奧曲肽與p300抑制胃癌細胞增殖的協(xié)同效應.pdf

1、研究背景：
　　調(diào)控細胞周期阻滯和細胞凋亡的鋅指蛋白(zinc finger protein which regulatesapoptosis and cell cycle arrest，ZAC)基因為抑癌基因，定位于人類染色體6q24-25。ZAC基因編碼的蛋白為具有7個鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，可誘導細胞凋亡和細胞Gl期阻滯，從而抑制腫瘤細胞生長。p300是1個具有組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（histone acetyltransfera

2、se，HAT）活性的轉(zhuǎn)錄輔因子，可在多個殘基乙?；?個核心組蛋白以及70個其它蛋白。前期的研究表明，生長抑素類似物奧曲肽（Octreotide,OCT）可上調(diào)胃癌細胞ZAC的表達，ZAC與p300蛋白相互作用，可上調(diào)p300-HAT活性，并顯著升高組蛋白H3賴氨酸14的乙?；?。
　　研究目的：
　　觀察p300與OCT對抑制胃癌細胞增殖是否具有協(xié)同效應；p300是否可上調(diào)胃癌細胞ZAC基因的表達。
　　材料與方法：

3、
　　1.野生型p300真核表達載體的鑒定將野生型p300質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸桿菌DH5α。提取質(zhì)粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，測序鑒定。
　　2.實驗分組將胃癌細胞SGC7901和BGC823隨機分為4組：實驗組1：LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染p300質(zhì)粒；實驗組2：終濃度為10nmol/L的OCT培養(yǎng)液，分別作用24h、48h和72h；實驗組3： p300轉(zhuǎn)染，OCT孵育（同實驗組2）；對照組，無p300

4、轉(zhuǎn)染，無OCT處理。
　　3.p300和OCT孵育對胃癌細胞增殖及細胞周期的效應應用MTT法和流式細胞術(shù)，觀察p300與OCT對胃癌細胞SGC7901和BGC823細胞增殖及細胞周期的效應。
　　4.p300和OCT孵育對ZAC和acK14-H3免疫反應性的效應應用熒光免疫細胞化學技術(shù)觀察ZAC和acK14-H3的免疫反應性（Immuno-reactivity，IR）。
　　5.統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(s±

5、x)表示，應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，P＜0.05為差異性有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.野生型p300真核表達載體的鑒定瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，野生型p300質(zhì)粒DNA片段長度與預期一致。野生型p300質(zhì)粒序列分析結(jié)果與GenBank序列一致。
　　2.MTT結(jié)果培養(yǎng)24h、48h和72h的胃癌細胞SGC7901對照組A值分別為0.413±0.010、0.725±0.037和0.862±0.012；p3

6、00組分別為0.271±0.010、0.274±0.039和0.194±0.025；OCT組分別為0.203±0.044、0.294±0.027和0.404±0.012；p300+OCT組分別為0.216±0.005、0.229±0.017和0.153±0.011。胃癌細胞 BGC823對照組 A值分別為0.463±0.019、0.782±0.032和0.921±0.050；p300組分別為0.285±0,011、0.230±0.028

7、和0.165±0.006；OCT組分別為0.235±0.032、0.342±0.047和0.408±0.021；p300+OCT組分別為0.195±0.036、0.184±0.023和0.116±0.018。實驗組與對照組比較，其細胞增殖能力明顯下降（P<0.01），但p300+OCT組與 OCT組無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)果表明，p300和OCT均可抑制胃癌細胞增殖，但p300與OCT無協(xié)同效應。
　　3.流式細胞實驗結(jié)果

8、流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，實驗組處于G0/G1期的細胞數(shù)顯著高于對照組（P<0.01），同時處于S期的細胞數(shù)顯著低于對照組（P<0.01），但p300+OCT組與OCT組無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)果表明，p300和OCT均可誘導胃癌細胞細胞周期阻滯，但p300與OCT無協(xié)同效應。
　　4.熒光免疫細胞化學結(jié)果培養(yǎng)24h、48h和72h的胃癌細胞SGC7901對照組ZAC IR的平均水平分別為0.455±0.038、0.492±0.

9、021和0.495±0.019；p300組分別為0.622±0.026、0.725±0.040和0.735±0.030；OCT組分別為0.534±0.037、0.629±0.039和0.754±0.058；p300+OCT組分別為0.661±0.021、0.732±0.033和0.827±0.025。胃癌細胞BGC823對照組分別為0.379±0.015、0.346±0.013和0.356±0.018；p300組分別為0.576±0.0

10、21、0.640±0.001和0.740±0.014；OCT組分別為0.573±0.025，0.671±0.020和0.711±0.015；p300+OCT組分別為0.582±0.021、0.610±0.048和0.829±0.010。實驗組ZAC IR的平均水平均顯著高于對照組（P<0.01），但p300+OCT組與OCT組無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，p300和OCT均可上調(diào)胃癌細胞ZAC基因表達，但p300與OCT無協(xié)同

11、效應。
　　培養(yǎng)24h、48h和72h的胃癌細胞SGC7901對照組acK14-H3 IR的平均水平分別為0.479±0.015、0.439±0.014和0.354±0.019；p300組分別為0.790±0.016、0.831±0.020和0.489±0.031；OCT組分別為0.562±0.037、0.671±0.020和0.807±0.019；p300+OCT組分別為0.661±0.029、0.685±0.015和0.619

12、±0.023。胃癌細胞BGC823對照組分別為0.416±0.025、0.392±0.021和0.395±0.019；p300組分別為0.831±0.020、0.752±0.032和0.555±0.039；OCT組分別為0.514±0.029，0.649±0.033和0.804±0.059；p300+OCT組分別為0.531±0.038，0.611±0.025和0.734±0.036。結(jié)果表明，p300和OCT均可上調(diào)胃癌細胞組蛋白H3