Dectin-1-磷脂酶Cγ信號通路在角膜上皮細胞抗真菌感染固有免疫階段作用的研究.pdf

1、目的：研究在人角膜上皮細胞抗煙曲霉菌菌絲抗原感染的固有免疫過程中，Dectin-1受體通過胞內(nèi)磷脂酶Cγ（Phospholipase Cγ，PLCγ）信號傳導通路產(chǎn)生免疫應答的作用機制。
　　方法：常規(guī)體外培養(yǎng)的人角膜上皮細胞（HCECs），隨機分為空白對照組、真菌刺激組和通路受體阻斷組，用煙曲霉菌菌絲抗原感染體外培養(yǎng)的HCECs，建立真菌感染的細胞模型，此為真菌刺激組，通路受體阻斷組分別用U73122（PLCγ抑制劑）、Pice

2、atannol（Syk抑制劑）及Laminarin（Dectin-1阻斷劑）預處理30min，后加入煙曲霉菌菌絲抗原刺激液。應用Real time-PCR和ELISA技術(shù)方法檢測不同時間點CXCL1和IL-8 mRNA和蛋白水平的表達情況。于5、15、30、45min用Western blot方法檢測通路蛋白 PLCγ及脾酪氨酸激酶（spleen-tyrosine kinase，Syk）的表達情況。激光掃描共聚焦顯微鏡檢測細胞內(nèi)Ca2+

3、變化。
　　結(jié)果：真菌菌絲抗原刺激HCECs后可引起CXCL1和IL-8 mRNA和蛋白水平表達升高，呈時間和濃度依賴性，時間為8h，濃度為5×106/ml時達高峰，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；抗原刺激后PLCγ磷酸化水平上調(diào)，30min達高峰。抑制PLCγ磷酸化能明顯下調(diào)CXCL1和IL-8的表達（p<0.05）；阻斷Dectin-1受體下調(diào)抗原引起的PLCγ磷酸化水平（p<0.05）。菌絲刺激 HCECs可明顯增強胞內(nèi)

4、Ca2+釋放，U73122和Laminarin預處理后的胞內(nèi)Ca2+釋放相比菌絲刺激組明顯降低（p<0.05）。菌絲刺激引起Syk磷酸化水平上調(diào)，阻斷Dectin-1受體能下調(diào)Syk的活化（p<0.05）。Syk的抑制也可以使PLCγ的磷酸化水平下調(diào)（p<0.05）。
　　結(jié)論： PLCγ作為Dectin-1的下游分子參與角膜上皮細胞抗真菌感染。煙曲霉菌菌絲抗原刺激人角膜上皮細胞可明顯增強胞內(nèi)Ca2+的釋放，Dectin-1/PL