大鼠馬尾神經損傷模型的建立與OcT-6基因的修復作用研究.pdf

1、背景：
　　馬尾神經的嚴重損傷導致的馬尾神經綜合征在腰椎疾病患者中較常發(fā)生，其病程發(fā)病急，且致殘率高。及時的外科手術治療，并根除腰椎原發(fā)病后，患者預后往往不佳，多殘留有膀胱、肛門括約肌的功能障礙?？紤]到目前手術治療只能做到局部減壓，去除誘因，為馬尾神經功能恢復創(chuàng)造可能條件，但始終無法直接修復馬尾神經功能的損傷。因此尋找新的治療馬尾神經損傷的方法就顯得尤為重要。
　　已有研究表明，馬尾神經損傷多是由雪旺細胞的損傷即脫髓鞘的病理

2、改變開始，繼而出現(xiàn)軸突變性并導致相應背根神經節(jié)(DRG)神經元甚至相應節(jié)段脊髓神經元的凋亡，從而出現(xiàn)CES的各種神經功能障礙。因此，探索一種能夠阻斷馬尾神經組織神經元細胞脫髓鞘改變和促進神經元細胞再髓鞘化的方法成為馬尾神經綜合征治療的重要研究方向。
　　OCT6是調控雪旺細胞(SC)的分化和髓鞘化的一個關鍵的細胞內轉錄因子，可能在神經組織早期發(fā)育中起到了重要的作用，并且有可能參與神經組織修復。目前在神經系統(tǒng)疾病治療的研究中，關鍵基

3、因過表達技術已成為新發(fā)展起來的極有前景的治療策略?；谌祟惷庖呷毕莅Y病毒(HIV)制備的慢病毒，不易誘發(fā)機體神經系統(tǒng)的免疫反應，且毒性較低，可長期穩(wěn)定的介導轉基因表達，治療基因表達的時效可以長達六個月，非常適用于修復神經損傷。已有研究通過慢病毒局部注射的方法治療中樞神經系統(tǒng)損傷和脊髓損傷，但有關慢病毒治療馬尾神經損傷的研究目前還未見報道。
　　本研究首先建立了新的大鼠馬尾神經壓迫損傷模型;其次構建OCT6過表達慢病毒載體并包裝OC

4、T6過表達慢病毒;再次將OCT6過表達慢病毒注射到相應受損馬尾神經周圍腦脊液中，以期通過慢病毒感染細胞過表達OCT6，促進髓鞘的再生和修復，從而達到修復馬尾神經功能的目的;最后，利用RNA-seq手段檢測大鼠發(fā)生馬尾神經損傷前后基因表達水平的改變，期望從中發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。
　　研究目的：
　　建立大鼠馬尾神經壓迫損傷模型;探索顯微注射（鞘內移植）方法大鼠蛛網膜下腔植入OCT6過表達慢病毒的可行性;觀察OCT6過表達慢病毒在

5、大鼠體內的感染情況和OCT6過表達后大鼠馬尾神經功能修復的情況;利用RNA-seq手段檢測大鼠發(fā)生馬尾神經損傷前后基因表達水平的改變，期望從中發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。
　　研究方法：
　　1、選取22只出生6周左右、體重約250克的實驗SD大鼠，將大鼠隨機分為3組:手術組組，n=10;假手術組，n=6;對照組，n=6。每只大鼠在腰4處咬除椎骨背脊，用電鉆在咬除部位鉆一1.2mm小孔，鉆透椎板，將一枚平頭1.4mm不銹鋼平頭釘旋入小

6、孔后X光機輔助觀察下鉆入椎管腰4/5，建立大鼠馬尾神經壓迫損傷模型。模型建立3天后，運用馬尾壓迫模型的BBB評分、馬尾壓迫模型的斜板實驗、馬尾壓迫模型的壓痛測試等判定各實驗組大鼠神經功能變化，確定模型建立成功。
　　2、獲得慢病毒過表達載體PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV;利用NCBI檢索大鼠OCT6 CDS全序列;通過PCR方法，從大鼠細胞提取RNA，反轉錄獲得CDNA，以CDNA為模版并設計引物擴增出大鼠OCT

7、6 CDS全序列;將OCT6 CDS全序列構建到慢病毒過表達載體PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV上，獲得PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV-OCT6重組質粒;最后進行PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV-OCT6慢病毒的包裝和滴度測定。
　　3、選取20只出生6周左右、體重約250克的實驗SD大鼠，將大鼠隨機分為2組:PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV-OCT6過表達慢病毒載

8、體鞘內注射組，n=10;對照慢病毒組，n=10。建立大鼠馬尾神經壓迫損傷模型。模型建立7天后，取出螺釘，分別鞘內注射PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV-OCT6慢病毒（8μl/只）和注射等量的PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV-Scramble慢病毒。術后在預設的時間點內，取大鼠馬尾神經組織進行免疫組化熒光染色，觀察病毒在體內的轉染、分布情況。并定期運用馬尾壓迫模型的BBB評分、馬尾壓迫模型的斜板實驗、馬尾壓

9、迫模型的壓痛測試判定各實驗組大鼠神經功能變化的恢復情況。
　　4、借助于最新的高通量測序技術，RNA-Seq來探究大鼠馬尾神經在損傷前后的基因表達改變，分析數(shù)據(jù)，探究其中深層次的分子機制。
　　結果：
　　1、成功建立并改進大鼠馬尾神經壓迫損傷模型。
　　2、PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV-OCT6過表達慢病毒包裝成功，病毒滴度滿足后續(xù)實驗需要。
　　3、PCDH-MCS-T2A-COPG

10、FP-MSCV-OCT6過表達慢病毒鞘內注射后1周的時間中，可以在模型鼠體內成功轉染。這表明宿主的腦脊液對于注射的PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV-OCT6過表達慢病毒來說是一個合適的微環(huán)境，并且通過行為學檢測模型大鼠的神經功能得到明顯的改善。馬尾壓迫模型的BBB評分、馬尾壓迫模型的斜板實驗結果表明經病毒注射后，病毒注射組大鼠的神經功能更加明顯的改善。
　　4、分析大鼠損傷馬尾神經的差異基因表達，通過目前通用的KE

11、GG Pathway分析，發(fā)現(xiàn)了五項高度相關的信號通路。
　　結論：
　　改進的馬尾神經壓迫動物實驗模型設計合理、穩(wěn)定性高、易于操作、復制性強。能真實有效的模擬腰椎管狹窄造成的馬尾神經損傷的病理過程。通過慢病毒感染的方法，髓鞘內注射OCT6過表達慢病毒可以有效的促進大鼠馬尾神經損傷的修復。OCT6過表達慢病毒在本實驗中促進大鼠馬尾神經損傷修復將通過后續(xù)實驗進一步驗證。OCT6大鼠體內促進神經髓鞘再生、恢復神經功能的機制尚待進