Caveolin-1-VEGF信號通路及Sema3A對大鼠星形膠質細胞OGD-R損傷的調節(jié)作用.pdf

1、目的：研究Caveolin-1/VEGF信號通路及Sema3A對大鼠星形膠質細胞OGD/R損傷的調節(jié)作用，探討缺血再灌注損傷后神經功能受損的機制。
　　方法：購買大鼠星形膠質細胞株，傳代培養(yǎng)，通過倒置光學顯微鏡觀察細胞生長形態(tài)，適時凍存或傳代。細胞分組:隨機分為正常對照組、氧糖剝奪/復氧模型組（Oxygen glucose deprivation and reoxygenation，OGD/R）、小凹蛋白-1(Caveolin-1

2、，Cav-1)基因沉默組、Cav-1基因沉默OGD/R組。對正常對照組的細胞常規(guī)培養(yǎng);對OGD/R組，在對數生長期缺氧缺糖6h復氧24h建立OGD/R模型;對Cav-1基因沉默組，利用慢病毒載體包裝的Cav-1 RNAi干擾細胞中的Cav-1建立Cav-1基因沉默模型;對Cav-1基因沉默OGD/R組，在Cav-1基因沉默的基礎上再建立OGD/R模型。指標檢測:CCK-8法檢測細胞存活率，熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)法檢測Ca

3、v-1、VEGF、Sema3A的mRNA的表達，免疫印跡(Western blot，Wb)法和免疫熒光法檢測Cav-1、VEGF、Sema3A的蛋白的表達。
　　結果：⑴細胞株傳代順利，以1×106的細胞密度鋪板，培養(yǎng)5h即貼壁生長，24h時呈現典型“鋪路石”樣形態(tài)，為對數生長期階段，說明大鼠星形膠質細胞培養(yǎng)成功。⑵OGD/R組細胞存活率低于正常對照組，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，說明成功建立大鼠星形膠質細胞OGD/R模

4、型。⑶基因沉默組的Cav-1mRNA表達、Cav-1蛋白表達均低于正常對照組，差異分別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05、P＜0.01)，說明成功建立Cav-1基因沉默模型。⑷Cav-1、VEGF、Sema3A的mRNA的表達：Cav-1mRNA表達分別與正常對照組比較，OGD/R組表達上升，Cav-1基因沉默組表達下降，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與OGD/R組比較，Cav-1基因沉默OGD/R組表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0

5、.05）；VEGF mRNA表達分別與正常對照組比較，OGD/R組、Cav-1基因沉默組以及Cav-1基因沉默OGD/R組的VEGF mRNA表達均下降，差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）;與Cav-1基因沉默組比較，Cav-1基因沉默OGD/R組表達下降，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01); OGD/R組與Cav-1基因沉默OGD/R組比較，VEGFmRNA表達無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；Sema3A mRNA表達與正常對照組

6、比較，OGD/R組表達上升，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。⑸Cav-1、VEGF、Sema3A的蛋白表達。Wb法結果：Cav-1表達分別與正常對照組比較，OGD/R組表達上升，Cav-1基因沉默組表達下降，Cav-1基因沉默OGD/R組表達下降，差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01);與OGD/R組比較，Cav-1基因沉默OGD/R組表達下降，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）;與Cav-1基因沉默組比較，Cav-1基因沉默O

7、CD/R組表達上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；VEGF表達分別與正常對照組比較，OGD/R組表達下降，Cav-1基因沉默組表達下降，差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；Sema3A表達分別與正常對照組比較，OGD/R組和Cav-1基因沉默OGD/R組表達上升，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。免疫熒光法結果：Cav-1表達分別與正常對照組比較，OGD/R組表達上升，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01);Cav-1基因沉默組

8、表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。與OGD/R組比較，Cav-1基因沉默OGD/R組表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與Cav-1基因沉默組比較，Cav-1基因沉默OGD/R組表達上升，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；VEGF表達與正常對照組比較，OGD/R組表達下降，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；Sema3A表達與正常對照組比較，OGD/R組表達上升，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。6.Cav-1與