WASP和Mst1在BCR信號中的調(diào)控作用及中國15例RAG病人的特征分析.pdf

1、第一、二部分 Wiskott-Aldrich綜合征患兒CD19共受體信號介導(dǎo)的記憶B細(xì)胞早期活化異常
　　WAS綜合征（Wiskott-Aldrich syndrome）是一種罕見的原發(fā)性免疫缺陷疾病，表現(xiàn)為自幼發(fā)病的濕疹、血小板減少和出血“三聯(lián)征”，易患自身免疫性疾病和腫瘤。如不盡早進(jìn)行干細(xì)胞移植或基因治療重建免疫患兒不能正常存活。WAS患者記憶B細(xì)胞體內(nèi)增殖能力受損。然而具體的分子機(jī)制還未明確。我們收集WAS患者和正常同齡對照

2、兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本，用T IRF m技術(shù)研究WAS患者幼稚B細(xì)胞和記憶 B細(xì)胞的早期活化事件，以期對其分子機(jī)制有所認(rèn)識?？乖碳ず驜細(xì)胞快速形成BCR聚集簇和細(xì)胞擴(kuò)張，是記憶B細(xì)胞能夠迅速激活并發(fā)揮免疫效應(yīng)的活化早期關(guān)鍵事件。對照組記憶 B細(xì)胞比幼稚B細(xì)胞能更快地形成BCR聚集簇，細(xì)胞擴(kuò)張能力更強(qiáng)。而這些關(guān)鍵事件在WAS患者記憶B細(xì)胞中是異常的。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)WAS患者記憶B細(xì)胞BCR信號的正向調(diào)控分子CD19-Btk信號降低且負(fù)向

3、調(diào)控分子FcγR IIB-SHIP-1信號增強(qiáng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)WAS蛋白促進(jìn)CD19轉(zhuǎn)錄水平，可以解釋W(xué)AS突變CD19共受體信號介導(dǎo)的記憶B細(xì)胞早期活化異常。
　　第三部分 Mst1通過CD19共受體轉(zhuǎn)導(dǎo)信號正向調(diào)節(jié)B細(xì)胞受體信號
　　作為Hip po信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，Ms t激酶是一個(gè)新興的關(guān)鍵信號分子，影響細(xì)胞的增殖、器官大小、細(xì)胞遷移和細(xì)胞極性。Ms t1缺乏導(dǎo)致邊緣區(qū)（MZ）B淋巴細(xì)胞發(fā)育缺陷。但Mst1如何

4、調(diào)節(jié)B細(xì)胞受體（BCR）的活化和 B細(xì)胞分化尚未有報(bào)道。利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型和膜相關(guān)抗原-TIRFm體系，本研究發(fā)現(xiàn)Mst1缺陷B細(xì)胞在膜相關(guān)抗原刺激后B細(xì)胞早期活化關(guān)鍵事件—BCR聚集簇形成障礙，B細(xì)胞擴(kuò)張受限，這可以解釋Mst1基因缺陷小鼠B細(xì)胞受體信號降低的現(xiàn)象。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Mst1通過調(diào)節(jié)BCR共受體CD19的基因轉(zhuǎn)錄水平正向調(diào)控BCR信號通路。而且Mst1缺陷導(dǎo)致CD19共受體信號介導(dǎo)的Btk信號減弱，進(jìn)而導(dǎo)致小鼠脾臟邊緣區(qū)B

5、細(xì)胞（MZB）和生發(fā)中心B細(xì)胞（GCB）分化嚴(yán)重受損。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，Mst1通過轉(zhuǎn)錄因子-TEAD2直接結(jié)合cd193'UTR的共識基序（consensus motif）來上調(diào)CD19的mRNA水平。因此，本研究揭示了Mst1調(diào)節(jié)外周B細(xì)胞的活化和分化的一個(gè)新機(jī)制。
　　第四部分中國15例R AG基因突變致患兒的臨床、免疫和基因特征
　　目的：重組激活基因1和重組激活基因2（Recombination Activati

6、ng Genes;RAG1, RAG2）對T和B淋巴細(xì)胞的發(fā)育和功能起關(guān)鍵作用。其編碼的 RAG1/2酶活性缺失往往導(dǎo)致典型嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷癥(severe combined immunodeficiency, SCID)和 Omenn綜合征（ Omenn syndrome），病情重，若不及時(shí)免疫重建，患兒多1歲內(nèi)死亡，死亡率極高。RAG突變導(dǎo)致的中國SCID和OS患兒的臨床、免疫和RAG突變遺傳特性還沒有詳細(xì)的研究報(bào)道。本文將探討中國

7、大陸15例R AG1/2基因缺陷患兒的臨床表現(xiàn)，評估免疫功能。
　　方法：收集2008年－2015年疑診R AG1/2缺陷患兒及家系標(biāo)本，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增R AG1/2基因，均通過查詢千人數(shù)據(jù)庫及NC BI dbS NP庫排除S NP，并通過mutation taster和poly-phen軟件預(yù)測致病可能性；Swiss model預(yù)測RAG1/2結(jié)構(gòu)變化；經(jīng)TRECs和TCRvb評估TCR組裝、發(fā)育及T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)評估T細(xì)胞功能

8、；精細(xì)免疫分型分析T/B淋巴細(xì)胞各亞群水平；T+B-NK+表型患兒經(jīng)STR分析是否有母體T細(xì)胞植入。
　　結(jié)果：本研究經(jīng)臨床表型、免疫學(xué)篩查和基因分析，本研究確診15例R AG1/2基因缺陷患兒，其中R AG1基因缺陷13例，RAG2基因缺陷2例；檢測出22個(gè)R AG基因突變，其中新發(fā)致病突變14種，包括10種R AG1新發(fā)突變（R108X、M630T、E510X、S666P、E669K、C730Y、A857V、K847E、L92

9、2PfsX7和L1025FfsX39）和4種RAG2新發(fā)突變（R73C、I427GfsX12、P432L和311insL）。在中國人群， L1025FfsX39是一個(gè)潛在的RAG1熱點(diǎn)突變。本研究發(fā)現(xiàn)R AG1基因突變的分布而不是突變類型在SCID和OS患者有所差異。盡管OS患兒T細(xì)胞數(shù)量正?；蛏?，但TCR受體多樣性、TCR基因重排、胸腺輸出和T細(xì)胞增殖嚴(yán)重受損，提示T淋巴細(xì)胞發(fā)育和功能嚴(yán)重受損。
　　結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)目前中國大