IQGAP1-N-WASP信號通路在肺炎衣原體感染促進血管內(nèi)皮細胞遷移及血管新生中的調(diào)控作用.pdf

1、目的:
　　利用肺炎衣原體（Chlamdia pneumoniae，C.pneumoniae）體外感染血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cell，VEC)模型，觀察C.pneumoniae感染對VEC遷移和血管新生的影響;探討IQGAP1-N-WASP信號通路在C.pneumoniae感染誘導VEC遷移和血管新生中的作用。
　　方法:
　　1.C.pneumoniae增殖培養(yǎng)后體外感染VEC;

2、r>　　2.采用Western blot技術檢測C.pneumoniae感染的VEC內(nèi)IQGAP1蛋白的表達水平;
　　3.免疫共沉淀法檢測C.pneumoniae感染后IQGAP1的磷酸化水平;
　　4.CCK-8檢測Src抑制劑PP2以及PKC抑制劑GF109203X和chelerythrine在使用濃度及作用時間內(nèi)對VEC活力的影響;
　　5.免疫熒光法確定PP2、GF109203X以及chelerythrine

3、在使用濃度及作用時間內(nèi)對C.pneumoniae感染率的影響;
　　6.分別用PP2、GF109203X和chelerythrine預處理后，免疫共沉淀法檢測C.pneumoniae感染后IQGAP1酪氨酸和絲氨酸磷酸化水平的變化;
　　7.用PP2、GF109203X和chelerythrine分別抑制IQGAP1的酪氨酸和絲氨酸磷酸化，wound-healing實驗和Transwell實驗與微管腔實驗觀察各組VEC遷移能

4、力和血管新生能力的改變;
　　8.肌動蛋白聚合實驗觀察C.pneumoniae感染VEC后IQGAP1與肌動蛋白的功能性定位;
　　9.免疫共沉淀確定IQGAP1與N-WASP之間的相互作用;
　　10.應用RNA干擾技術使IQGAP1表達水平下調(diào)，Western blot檢測IQGAP1的蛋白表達以確定干擾效能;
　　11.應用RNA干擾技術使IQGAP1表達水平下調(diào)，共聚焦顯微鏡觀察C.pneumoniae感

5、染后VEC內(nèi)肌動蛋白和N-WASP的共定位情況，Western blot檢測C.pneumoniae感染后VEC中N-WASP磷酸化水平。
　　結(jié)果:
　　1.C.pneumoniae感染VEC后各個時間點的IQGAP1蛋白表達水平與0h比較無明顯變化;
　　2.C.pneumoniae感染VEC10h和24h后，IQGAP1絲氨酸和酪氨酸磷酸化水平均明顯高于正常對照組(P＜0.05)，感染后24h IQGAP1絲氨酸

6、磷酸化水平高于10h(P＜0.05)，而10h和24h時間點之間的酪氨酸磷酸化水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);
　　3.CCK-8實驗結(jié)果顯示，分別與正常對照組相比1μmol/L PP2、1μmol/L GF109203X和5μmol/L chelerythrine在作用時間內(nèi)對VEC活力無明顯影響，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);
　　4.使用PP2、GF109203X以及chelerythrine預處理的各組V

7、EC的C.pneumoniae感染率無明顯差異，而且此感染率與C.pneumoniae感染組相比均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);
　　5.感染24h后，C.pneumoniae感染+PP2組VEC的IQGAP1酪氨酸磷酸化水平明顯低于單純C.pneumoniae感染組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，C.pneumoniae感染+GF109203X組以及C.pneumoniae感染+chelerythrine組VEC的IQGAP

8、1絲氨酸磷酸化水平也均明顯低于單純C.pneumoniae感染組（P＜0.05）;
　　6.Wound healing實驗結(jié)果顯示，PP2、GF109203X和chelerythrine預處理的C.pneumoniae感染組VEC向劃痕中央遷移的面積明顯小于單純C.pneumoniae感染組(P＜0.05)。Transwell實驗結(jié)果顯示，PP2、GF109203X和chelerythrine預處理的C.pneumoniae感染組

9、VEC穿膜細胞數(shù)明顯低于單純C.pneumoniae感染組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義;微管腔形成實驗結(jié)果表明，與正常對照組相比，C.pneumoniae感染后VEC形成微管腔結(jié)構(gòu)的能力明顯增強（P＜0.05），但是，經(jīng)PP2、GF109203X和chelerythrine預處理后C.pneumoniae感染的這種效應則明顯減弱(P＜0.05);
　　7.C.pneumoniae感染后VEC內(nèi)肌絲聚合，且在細胞“l(fā)eadin

10、g edge”處聚集增多;IQGAP1聚集于肌絲聚合處，呈重合狀態(tài);
　　8.C.pneumoniae感染VEC10h后，免疫共沉淀結(jié)果顯示，在65kDa處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，符合N-WASP蛋白的分子量大小;
　　9.siRNA轉(zhuǎn)染后48h，三個濃度組的IQGAP1蛋白表達水平均明顯下降，分別為正常對照組的18.27％、17.33％和17.18％;
　　10.共聚焦顯微鏡觀察，C.pneumoniae感染后VEC內(nèi)肌

11、絲聚合，N-WASP與肌絲共定位于細胞“l(fā)eading edge”處，而沉默IQGAP1的表達后該效應受到抑制。與正常對照組相比，C.pneumoniae感染組N-WASP磷酸化水平明顯升高(P＜0.05)，而沉默IQGAP1的表達后，N-WASP磷酸化水平則顯著降低，低于C.pneumoniae感染組（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　C.pneumoniae感染可能是通過促使IQGAP1的酪氨酸位點和絲氨酸位點發(fā)生磷酸化