TRH與p-ERK1-2、FosB-ΔFosB形成的正反饋環(huán)路參與左旋多巴誘發(fā)異動(dòng)癥發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、本文分為以下幾個(gè)部分:
　　第一部分:LID發(fā)生、發(fā)展與TRH、p-ERK1/2、FosB-ΔFosB等相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)變化之間關(guān)系的研究
　　目的:明確LID發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中大鼠紋狀體全轉(zhuǎn)錄本及主要標(biāo)志信號(hào)分子表達(dá)水平變化。
　　方法給予SD大鼠6-OHDA（2μg/μl,4μl）內(nèi)側(cè)前腦束立體定向注射，復(fù)制偏側(cè)急性PD模型，在術(shù)后14天通過(guò)跨步試驗(yàn)、阿樸嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)檢測(cè)模型。對(duì)于成功PD模型，3天后給予左旋多巴

2、（12mg/kg）和芐絲肼（6mg/kg）治療，每天規(guī)律腹腔注射一次，共21天，復(fù)制偏側(cè)LID大鼠模型。隔天一次對(duì)大鼠行為學(xué)進(jìn)行AIMs評(píng)分；通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)大鼠黒質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元?dú)p情況；通過(guò)基因芯片技術(shù)檢測(cè)PD大鼠與LID大鼠紋狀體區(qū)mRNA全轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)差異；通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)紋狀體區(qū)TRH與FosB轉(zhuǎn)錄水平的變化,通過(guò)免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)TRH與FosB-ΔFosB在紋狀體的共表達(dá)情況，通過(guò)Western blot等技

3、術(shù)檢測(cè)紋狀體區(qū)TRH、FosB-ΔFosB與p-ERK1/2表達(dá)水平。
　　結(jié)果:與PD大鼠相比，LID大鼠毀損側(cè)紋狀體區(qū)TRH mRNA水平顯著升高（P＜0.001）。毀損側(cè)紋狀體背外側(cè)區(qū)TRH與FosB-ΔFosB共表達(dá)；在非毀損側(cè)未見二者的表達(dá)。TRH mRNA在L-DOPA給藥后處于持續(xù)高水平表達(dá)狀態(tài)。LID大鼠毀損側(cè)紋狀體區(qū)TRH、FosB-ΔFosB與p-ERK1/2蛋白水平均高于PD大鼠。
　　結(jié)論:LID的發(fā)

4、生與發(fā)展伴隨大鼠毀損側(cè)紋狀體TRH的持續(xù)高表達(dá)，并且異常表達(dá)的TRH可能與LID標(biāo)志信號(hào)分子FosB-ΔFosB相關(guān)。
　　第二部分:TRH對(duì)LID發(fā)生、發(fā)展及對(duì)p-ERK1/2等相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)影響的研究
　　目的:觀察上調(diào)或下調(diào)TRH對(duì)LID大鼠行為學(xué)及紋狀體區(qū)p-ERK1/2、ΔFosB等相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)的影響，明確TRH是否可以直接調(diào)控p-ERK1/2的磷酸化水平。
　　方法:在偏側(cè)LID大鼠模型基礎(chǔ)上，每天一

5、次通過(guò)顱內(nèi)置管技術(shù)向紋狀體背外側(cè)區(qū)立體定向注射TRH三肽或TRH類似物Taltirelin，同時(shí)30分鐘后給予腹腔注射左旋多巴和芐絲肼，持續(xù)1周。包裝慢病毒LV-TRH-shRNA-GFP,感染PC12細(xì)胞，篩選可以有效干擾TRH mRNA的序列。將TRH有效干擾序列包裝成腺相關(guān)病毒AAV-TRH-shRNA-GFP,并立體定向注射至紋狀體背外側(cè)區(qū)，4周后開始給予每天一次腹腔注射左旋多巴和芐絲肼，持續(xù)1周，每天進(jìn)行AIMs評(píng)分，第7天處

6、死大鼠并檢測(cè)紋狀體區(qū)TRH、p-ERK1/2、FosB-ΔFosB的表達(dá)水平。培養(yǎng)PC12細(xì)胞，分別用溶劑（Vehicle）、MEK抑制劑（U0126）、TRH受體TRH-R1抗體（Anti-TR1）孵育細(xì)胞，2小時(shí)后分別給予細(xì)胞TRH三肽、TRH類似物Taltirelin干預(yù)，通過(guò)Western Blot技術(shù)檢測(cè)p-ERK1/2的磷酸化水平在不同處理?xiàng)l件下的差異。結(jié)果TRH三肽、TRH類似物Taltirelin均可以顯著加重異動(dòng)癥，增

7、加p-ERK1/2、Δ
　　結(jié)果:FosB的表達(dá)；AAV-TRH-shRNA下調(diào)TRH表達(dá)可以顯著減輕異動(dòng)癥，減少p-ERK1/2、ΔFosB的表達(dá)。TRH三肽、TRH類似物Taltirelin可以明顯增加p-ERK1/2的磷酸化水平，并且這種升高效應(yīng)可以被MEK抑制劑U0126及TRH-R1抗體所抑制。
　　結(jié)論:TRH通過(guò)正向調(diào)控ERK1/2磷酸化與ΔFosB的表達(dá)而參與LID的發(fā)生與發(fā)展。
　　第三部分:p-ER

8、K1/2對(duì)FosB-ΔFosB與FosB-ΔFosB對(duì)TRH表達(dá)調(diào)控的研究
　　目的:觀察MEK抑制劑U0126對(duì)LID大鼠行為學(xué)以及FosB-ΔFosB、TRH等信號(hào)分子的調(diào)控。通過(guò)過(guò)表達(dá)FosB基因，明確FosB-ΔFosB對(duì)TRH的調(diào)控。
　　方法:在偏側(cè)PD大鼠模型基礎(chǔ)上，給予每天一次腹腔注射左旋多巴和芐絲肼，持續(xù)21天。隔天一次進(jìn)行AIMs評(píng)分。自左旋多巴給藥第10天起，每天提前30分鐘通過(guò)留置導(dǎo)管向紋狀體立體定向

9、注射MEK抑制劑U0126，第21天處死大鼠，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)TRH mRNA、FosB mRNA表達(dá)水平，通過(guò)Western Blot技術(shù)檢測(cè)p-ERK1/2、ΔFosB等信號(hào)分子的表達(dá)。包裝過(guò)表達(dá)FosB基因慢病毒LV-FosB-GFP，感染PC12細(xì)胞，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)TRH mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:MEK抑制劑U0126可以顯著降低AIM行為學(xué)評(píng)分，減輕異動(dòng)癥，減少FosB-ΔFosB、TRH的表