雙鏈RNA對細胞凋亡和HBV復制的影響及細胞黏附對藥物誘導凋亡的影響.pdf

1、研究表明,長雙鏈RNA會引發(fā)干擾素(interferon,IFN)防御途徑的激活,從而激活雙鏈RNA依賴蛋白激酶(Double-strandedRNA-dependent protein kinase,PKR),使其與長雙鏈RNA結合形成二聚體,一方面磷酸化真核細胞翻譯起始因子(eukaryotic InitiationFactor-2 alpha,elF-2α),抑制蛋白質合成,導致細胞凋亡;另一方面,磷酸化轉錄因子NF-KappaB

2、的抑制因子,使NF-KappaB活化,引起IFN相關刺激因子啟動子激活,導致IFN轉錄增加。為研究長雙鏈RNA誘導細胞凋亡的機制,我們以長雙鏈RNA、短雙鏈RNA分別轉染HepG2.215細胞后,定量RT-PCR檢測干擾素表達、DNA FragmentationELISA檢測凋亡。結果表明,長雙鏈RNA使細胞中IFN表達水平上調,凋亡增加,而短雙鏈RNA不會引起IFN水平的上調和凋亡。
　　 RNA干擾(RNA Interfer

3、ence,RNAi)是指內源性或外源性雙鏈RNA(Double-stranded RNA,dsRNA)在細胞內特異性的降解同源mRNA,致靶基因的表達沉默。dsRNA進入細胞,在Dicer的切割下生成21-23nt的短鏈dsRNA,即小干擾RNA(Small Interfering RNA,siRNA),隨后結合核酶復合物形成RNA誘導沉默復合體(RNA inducedsilencing complex,RISC),RISC識別同源性的

4、mRNA并將其降解。我們選取長雙鏈RNA(即dsRNA)、短雙鏈RNA(即siRNA)轉染HepG2.215細胞,ELISA測得細胞上清中HBsAg和HBeAg的含量,與對照組相比,HBsAg、HBeAg含量降低,說明通過RNAi可以抑制HBV的復制。
　　 在前述的轉染過程中我們發(fā)現(xiàn),細胞貼壁更緊密時,后續(xù)轉染過程測定的凋亡率低于貼壁不緊密的細胞組。因此,我們推測細胞的黏附強弱不N會影響細胞的凋亡。為證實假設,我們選用IFN、

5、5-氟尿嘧啶分別誘導經(jīng)不同處理因素作用后的HepG2、HEK293細胞,實驗發(fā)現(xiàn),經(jīng)多聚賴氨酸預處理后的培養(yǎng)板,會增強細胞的貼壁生長能力,使細胞對藥物的敏感性下降,增殖抑制率、凋亡率均下降;而在細胞未貼壁時加入Fn抗體阻斷基質中重要成分一纖維粘連蛋白(Fn)后,會使細胞對藥物的敏感性增加,增殖抑制率、凋亡率均上升;IFN作用不同黏附作用處理后的細胞組,Western檢驗其PKR水平均升高,但組間無明顯差異。
　　 綜合前述各項研