SRB方法定量檢測體外誘導的HaCaT細胞凋亡及人參皂甙對凋亡的影響.pdf

1、最近的研究表明角質形成細胞的凋亡在濕疹性皮炎慢性化中起著關鍵的作用。角質形成細胞的凋亡導致細胞間連接的破壞，真皮內水分滲入表皮內，在表皮內形成海綿樣病變，這可以使皮膚的屏障功能受到損害，從而加重濕疹性皮炎。因此，角質形成細胞的凋亡為濕疹性皮炎慢性化的轉折點，阻斷角質形成細胞的凋亡可以減輕濕疹慢性化進程的發(fā)生，從而為濕疹性皮炎的治療提供了一條新的途徑，成為藥物篩選的一個新靶點。流式細胞儀可以定量檢測細胞的凋亡，此方法雖然敏感準確，但是需要

2、一定量的細胞和大量的試劑，并且操作復雜、耗時，不適合用于高通量的藥物篩選。SulphorhodamineB(SRB)和Microtetrazolium(MTT)方法是檢測細胞增殖情況的快速、簡便的96孔板檢測方法，如果能區(qū)分出細胞的增殖抑制是由凋亡而不是壞死引起的，就可用此方法初步篩選抑制細胞凋亡的藥物。本實驗中用干擾素-γ(IFN-γ)和抗Fas單克隆抗體(antiFasAb)共同作用誘導角質形成細胞HaCaT凋亡，部分模擬濕疹性皮炎

3、的發(fā)病機制，以用于篩選治療濕疹性皮炎的藥物。通過比較SRB和MTT兩種檢測方法選用更敏感、準確的SRB方法以及用流式細胞儀同步監(jiān)測SRB檢測結果，建立了用SRB初步篩選抗細胞凋亡藥物的方法，從而為篩選濕疹性皮炎的治療藥物奠定了實驗基礎。 方法：IFN-γ和antiFasAb單獨或聯(lián)合作用于體外培養(yǎng)的角質形成細胞株HaCaT，流式細胞儀檢測細胞表面Fas抗原的表達和細胞的凋亡情況并檢測caspase抑制劑z-VAD-FMK對HaC

4、aT細胞凋亡的影響。比較SRB和MTT方法在線性、日內變異及日間變異上的差異，選用更精確的方法檢測HaCaT細胞的增殖情況。流式細胞儀同步檢測SRB方法的檢測結果，以確定用SRB方法篩選抑制角質形成細胞HaCaT凋亡的人參皂甙。 結果：(1)流式細胞儀檢測結果顯示IFN-γ濃度分別為0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml時，HaCaT細胞表面的Fas抗原表達分別49.66﹪±6.90、63.5

5、4﹪±6.38、71.41﹪±6.03、77.58﹪±5.92、79.31﹪±4.80。1ng/ml的IFN-γ上調Fas表達不明顯(P＞0.05)，但是10ng/ml以上濃度的IFN-γ可顯著增加Fas表達(P＜0.05)。(2)流式細胞儀檢測結果顯示50ng/ml的IFN-γ和25ng/ml的antiFasAb共同作用可以誘導角質形成細胞HaCaT凋亡，凋亡率可達到21.5﹪。Caspase抑制劑z-VAD-FMK可有效抑制IFN-

6、γ和antiFasAb共同作用引起的HaCaT細胞凋亡。(3)SRB方法和MTT方法都有非常好的線性，相關系數分別為0.99896和0.99724，兩種方法間無顯著性差異。SRB和MTT方法在日內變異上無顯著性差異，而在日間變異上SRB方法小于MTT方法，兩種方法間有顯著性差異。(4)流式細胞儀與SRB方法同步檢測結果表明，固定IFN-γ濃度為50ng/ml，添加antiFasAb25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、0.5

7、μg/ml、1μg/ml時，流式細胞儀檢測的細胞凋亡率分別為25.39﹪、24.39﹪、28.4﹪、31.58﹪、40.52﹪、46.67﹪，而SRB方法檢測的細胞增殖抑制率分別為29.8﹪、30.69﹪、32.79﹪、36.83、43.69、47.19﹪，兩種方法檢測結果的相關系數為0.9934，應用兩組間t檢驗，P＞0.05,在統(tǒng)計學上無顯著性差異。(5)人參皂甙Mx、CK和Re對HaCaT細胞凋亡有一定的抑制作用，抑制率分別為18

8、.4﹪、14.5﹪、9.6﹪。 結論：(1)IFN-γ和antiFasAb共同作用可誘導角質形成細胞HaCaT凋亡。(2)SRB方法比MTT方法更靈敏、更穩(wěn)定，更適合藥物的高通量篩選。(3)流式細胞儀與SRB方法同步檢測結果顯示，在明確細胞的增殖抑制是由凋亡而非壞死引起時，SRB方法可以用于凋亡的定量檢測，即SRB方法可用于初步篩選抑制細胞凋亡的藥物。(4)人參皂甙Mx，CK，和Re對IFN-γ和antiFasAb誘導的HaCa