基于磁共振的硫氧還蛋白還原酶結(jié)構(gòu)的表征.pdf

1、生物大分子在溶液中的結(jié)構(gòu)（二級結(jié)構(gòu)，三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)）對于它們的生物功能具有決定作用。NMR(Nuclearmagneticresonance)是在接近生理環(huán)境的溶液中確定生物分子結(jié)構(gòu)和動力學(xué)的一種方法，因此廣受關(guān)注。目前，生物NMR蓬勃發(fā)展，已成為一個相對獨立的領(lǐng)域，這個領(lǐng)域的主要熱點是用各種NMR方法去闡明蛋白質(zhì)或脫氧核糖核酸(DNA)等生物大分子的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)變化。生物NMR研究中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析發(fā)展迅速。蛋白質(zhì)是基因表達的產(chǎn)物及

2、基因功能的實施者，其結(jié)構(gòu)表征與構(gòu)象的表征對于理解其功能非常重要。本論文主要以一種重要的氧化還原酶-硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxinreductase，簡稱TrxR)為對象，通過各種NMR技術(shù)和生物學(xué)手段來對其基本結(jié)構(gòu)進行表征，以期明確其氧化還原機制。
　　TrxR是一種NADPH依賴的包含有FAD結(jié)構(gòu)域的二聚體硒酶，屬于吡啶核苷酸——二硫化物氧化還原酶家族體系。它的每個亞基中存在著NADPH區(qū)和FAD區(qū)兩個功能結(jié)構(gòu)域，在生

3、物體內(nèi)，這兩個區(qū)域在發(fā)揮其生物功能的過程中會發(fā)生結(jié)構(gòu)的動態(tài)旋轉(zhuǎn)，從而導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定。因此其表達和溶液結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定控制困難，是我們研究面臨的主要困難，本論文主要針對以上問題進行了2個方面的研究:
　　(1)為了明確TrxR的結(jié)構(gòu)變化特征，我們在接近細胞體液的環(huán)境中對硫氧還蛋白進行了核磁共振的探究。為了克服TrxR結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性對于實驗過程中核磁共振信號的采集造成的困難，我們尋找了一些可以將其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的方法，比如將其中的半胱氨酸進行

4、突變，將兩個結(jié)構(gòu)域切開，在無氧的條件下與還原劑反應(yīng)等方法，還用了熒光光譜法和圓二色譜法對其結(jié)構(gòu)的變化進行了觀測。進而結(jié)合氘代與選擇性標記的方法，采集了一系列基于TROSY的核磁共振二維和三維譜圖，初步得到了一部分氨基酸殘基信號的歸屬。
　　(2)由于生物樣品溶液中溶劑水的核磁共振信號非常強，對溶質(zhì)信號的辨別造成一定程度的干擾，因此我們還系統(tǒng)的對一些NMR溶劑抑制技術(shù)進行了比較，以便為相關(guān)研究提供指導(dǎo)。我們發(fā)現(xiàn)，不同的溶劑峰壓制方法