利用硫氧還蛋白還原酶對卷煙毒理特征的初探.pdf

1、吸煙是被公認為引起很多疾病的重要因素，尚不能戒煙人群宜使用低危害卷煙。煙氣中成分及其復雜，含有超過5600種的化學成分，其中158種已被確認對人體有危害，同時也存在很多因素可以影響煙氣中可吸入到人體內(nèi)的有害物質(zhì)的成分及含量，例如煙草的加工方式、煙葉的干燥程度、卷煙的儲存環(huán)境、煙葉的品種及培養(yǎng)條件和卷煙過濾嘴的材料等等，這些因素加在一起使得卷煙的安全性評價操作非常復雜?，F(xiàn)階段卷煙危害性評價主要依賴化學成分分析及細胞毒評價方法。由于煙氣成分

2、極其復雜，不同有害成分往往此消彼漲，依賴于幾類物質(zhì)評價有一定局限性。另一方面，細胞毒的評價方法實驗周期長、成本高，不可能進行多種卷煙比較，不具有高通量的特性。綜上，低危害卷煙研發(fā)需要高通量的評價方法。
　　硫氧還蛋白（Trx）系統(tǒng)在機體中在促進細胞增殖、維持氧化還原平衡及抑制細胞凋亡等方面發(fā)揮著重要作用，它主要由Trx、硫氧還蛋白還原酶（TrxR）和磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）組成。TrxR是一種二聚體含硒酶，因在TrxR

3、蛋白結構表面含有獨特的硒半胱氨酸基團（Sec），其化學反應非?；顫?易被眾多親電子化合物修飾并失活；卷煙煙氣中含有多種如丙烯醛等不飽和親電子化合物，可與TrxR快速發(fā)生反應，故我們猜測卷煙煙氣提取液（CSE）能夠抑制TrxR活力，不同卷煙所制CSE抑制TrxR活力的能力不同。結果表明，TrxR是CSE敏感靶蛋白，CSE可迅速、劑量依賴地抑制小鼠肝勻漿TrxR活力；在所比較18種卷煙中，CSE抑制小鼠肝勻漿TrxR活力可達2.6倍不同；通

4、過在人舌鱗癌細胞（Tca8113）、結腸癌細胞（CT-26）、大鼠血管平滑肌細胞（VSMC）、肝癌細胞（HepG2）四種細胞進行CSE的細胞毒分析，我們發(fā)現(xiàn)抑制TrxR能力強的CSE具有高細胞毒性，三種CSE在四種細胞模型上均劑量依賴地產(chǎn)生細胞毒性，且不同模型、不同CSE濃度情況下均顯示具有高TrxR抑制能力的CSE能產(chǎn)生較嚴重的細胞毒性。細胞毒方法已被廣泛用于評價卷煙安全性，但是復雜的操作步驟和較長的實驗周期等特點使得細胞毒方法并不能

5、適用于同時比較多個卷煙樣品。相對于細胞毒評價，本方法具有簡單、快捷、準確及可實現(xiàn)高通量等特性，并且可以作為一種很好的預測卷煙細胞毒性的輔助方法，本研究方法可促進煙草行業(yè)深入研究農(nóng)業(yè)與工業(yè)措施對卷煙危害性的影響，從而加速低危害卷煙的研發(fā)進程。
　　為了進一步探究CSE作用于Trx系統(tǒng)的機理，本文在Tca細胞層面上進行了一系列的毒理分析，具體操作方法為Tca細胞分別與含1.5％或3%的CSE孵育2小時，收集并破碎細胞，收取上清液并進行

6、指標檢測，發(fā)現(xiàn)CSE干預Trx系統(tǒng)主要通過如下幾個方式：CSE中的不飽和親電子化合物可快速與Sec結合并烷化TrxR蛋白；CSE的干預使得細胞內(nèi)部產(chǎn)生氧化逆境進而促進TrxR蛋白發(fā)生交聯(lián)作用，降低TrxR的活性；CSE中的不飽和親電子化合物可與Trx中的活性巰基結合烷化Trx蛋白；CSE的干預使得細胞內(nèi)部產(chǎn)生氧化逆境進而使Trx發(fā)生氧化。通過以上結果，我們發(fā)現(xiàn)CSE可全方位的作用于Trx系統(tǒng)，使得Trx系統(tǒng)的維持氧化還原平衡能力以及促進

7、細胞增殖和抑制細胞凋亡等作用大打折扣，對細胞乃至于機體造成損傷，進而產(chǎn)生細胞或者組織病變甚至致癌等效果。
　　通過借助小鼠肺部滴注技術，我們實現(xiàn)了CSE直接接觸活體小鼠肺部組織，進而在體外研究的形式下觀察CSE對小鼠肺部組織的影響。具體操作方法為首先配置較高濃度CSE，實驗小鼠共分3組，一組滴注CSE，一組滴注生理鹽水，一組不做滴注處理作為對照，所需滴注的處理小鼠每隔一天滴注一次，共滴注五次，在最后一次滴注操作后24小時處死小鼠，

8、并取肺部組織做成勻漿液和切片，進而進行指標分析。結果表明，本實驗所用的CSE滴注劑量并沒有降低肺部組織中TrxR的活力水平，也沒有促進TrxR蛋白在肺部組織的積累，但是在肺部切片水平上，我們發(fā)現(xiàn)滴注CSE處理的小鼠肺部組織明顯出現(xiàn)損傷，與對照組與滴注生理鹽水組相比，病變整體較嚴重，肺泡壁毛細血管擴張充血、出血，有纖維素、炎性細胞滲出，肺泡破裂、出血、變形嚴重。通過對肺部組織mRNA進行熒光定量PCR分析并篩選，我們發(fā)現(xiàn)與對照組和滴注生理