ACTC1基因與先天性心臟病的相關(guān)研究及其作用機(jī)制探討.pdf

1、前言：先天性心臟病(Congenital Heart Disease，CHD)是常見重大出生缺陷，在活產(chǎn)兒中發(fā)病率為4.05‰～12.3‰，占新生兒非感染性死亡原因首位。80％CHD僅表現(xiàn)為心臟畸形而不伴有其他系統(tǒng)先天異常，稱為單純性CHD。長(zhǎng)期研究證實(shí)CHD主要由于胚胎時(shí)期遺傳與環(huán)境因素共同作用引起，其中遺傳因素具有重要作用，遺傳率為55％～65％。
　　 關(guān)于CHD的分子遺傳學(xué)研究有助于闡明其發(fā)生機(jī)制，從而使預(yù)防成為可能。不

2、僅如此，有證據(jù)提示某些CHD相關(guān)基因還參與成體心臟正常功能的維護(hù)。心臟的形成過(guò)程十分復(fù)雜，涉及在很短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞的精確遷移、分化和多種來(lái)源細(xì)胞的整合，其間的遺傳或環(huán)境因素所引起的任何紊亂都可能導(dǎo)致CHD。這也是CHD一直保持較高發(fā)病率的原因。既往研究已證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子異常是CHD的主要遺傳學(xué)病因，其中NKX2-5、TBX5、GATA4為單純性CHD3個(gè)最主要的致病基因。大量研究證實(shí)TBX5可通過(guò)蛋白-蛋白相互作用在心臟早期發(fā)育中扮演關(guān)鍵角色。

3、
　　 本課題組之前對(duì)61個(gè)單純性CHD核心家系、共216位成員TBX5基因的8個(gè)外顯子進(jìn)行了突變檢測(cè)，盡管未發(fā)現(xiàn)任何突變，但證實(shí)TBX5基因的表達(dá)呈下降趨勢(shì)。據(jù)此推測(cè)該變化可導(dǎo)致與TBX5相互作用的其它因子作用異常，再通過(guò)某種途徑影響心臟正常發(fā)育，最終導(dǎo)致心臟畸形。
　　 為深入明確此途徑，本研究應(yīng)用免疫共沉淀法，篩選出與TBX5相互作用的蛋白，經(jīng)質(zhì)譜分析及Western Blot驗(yàn)證確定該蛋白為心臟α肌動(dòng)蛋白(Alp

4、ha-cardiacactin，ACTC1)。
　　 區(qū)別于以往CHD相關(guān)基因多為轉(zhuǎn)錄因子，ACTC1基因?yàn)橐环N心臟特異表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因。多數(shù)研究提示此基因異常與心肌病(肥厚型心肌病及擴(kuò)張型心肌病)的發(fā)生密切相關(guān)。2008年Matsson等在對(duì)房間隔缺損(atrial septal defect，ASD)家系的研究中發(fā)現(xiàn)，該基因突變可導(dǎo)致家族性房間隔缺損。本研究旨在進(jìn)一步探討ACTC1基因與散發(fā)單純性先天性心臟病的關(guān)系，并從基因調(diào)

5、控、心肌細(xì)胞凋亡方面探討其導(dǎo)致心臟發(fā)育異常機(jī)制。
　　 方法：
　　 標(biāo)本：33例先天性心臟病及12例心臟結(jié)構(gòu)正常心肌組織標(biāo)本由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院、陸軍總院心臟外科及沈陽(yáng)軍區(qū)第202醫(yī)院病理科提供，標(biāo)本使用經(jīng)患者監(jiān)護(hù)人知情并同意。成年SD大鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵照動(dòng)物保護(hù)條例。H9C2(大鼠胚胎心肌細(xì)胞)購(gòu)自上海生科院細(xì)胞庫(kù)。
　　 1、ACTC1基因與先天性心臟病的相關(guān)性研究(1)DNA直

6、接測(cè)序檢測(cè)ACTC1基因編碼區(qū)突變PCR擴(kuò)增33例先天性心臟病心肌組織標(biāo)本ACTC1基因編碼外顯子，直接測(cè)序法篩查編碼外顯子突變情況。
　　 (2)實(shí)時(shí)定量RT-PCR，免疫組織化學(xué)及Western-Blot法研究ACTC1基因在CHD心肌組織中的表達(dá)分別提取CHD及心臟結(jié)構(gòu)正常心肌組織RNA和蛋白質(zhì)，予實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western-Blot檢測(cè)ACTC1基因mRNA及蛋白表達(dá)；制備上述心肌組織石蠟包埋切片，免疫組織化學(xué)

7、方法檢測(cè)ACTC1蛋白定位及表達(dá)。
　　 (3)TUNEL法檢測(cè)CHD心臟組織心肌細(xì)胞凋亡及其與ACTC1基因表達(dá)相關(guān)性分析石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，蛋白質(zhì)酶K消化，TdT酶和核苷酸混合液孵育，DAB顯色，復(fù)染，抗ACTC1抗體特異染色標(biāo)記心肌細(xì)胞，脫水，封片。顯微鏡下計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。對(duì)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比率與ACTC1基因表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)分析。
　　 (4)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)心肌組織Caspase-3、B

8、cl-2基因表達(dá)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)CHD心肌組織凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bcl-2 mRNA表達(dá)(5)RNA干擾設(shè)計(jì)合成Actc1-siRNA，轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞系，提取轉(zhuǎn)染后RNA及蛋白，實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western Blot檢測(cè)Actc1-siRNA干擾效應(yīng)。
　　 (6)TUNEL法檢測(cè)RNAi后心肌細(xì)胞凋亡將轉(zhuǎn)染后心肌細(xì)胞固定，TdT酶及核苷酸混合液孵育，DAB顯色，復(fù)染，脫水，封片，顯微鏡下觀察、計(jì)

9、數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。
　　 (7)AnnexinV/PI雙染及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡將轉(zhuǎn)染后H9C2細(xì)胞進(jìn)行AnnexinV/PI雙染后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡心肌細(xì)胞率。
　　 (8)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后H9C2細(xì)胞Caspase-3、Bcl-2基因表達(dá)收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，提取總RNA，實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Caspase-3，Bcl-2 mRNA表達(dá)。
　　 2、NKX2.5調(diào)控Actc

10、1基因表達(dá)的研究(1)Western-Blot、免疫組織化學(xué)、細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)NKX2.5及ACTC1表達(dá)Western-Blot檢測(cè)E12.5d大鼠胎鼠心臟組織中NKX2.5及ACTC1表達(dá)；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)E12.5d大鼠胎鼠心臟中ACTC1組織定位。細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)NKX2.5及ACTC1在大鼠胎鼠心肌細(xì)胞系H9C2中細(xì)胞定位。
　　 (2)P-MATCH軟件預(yù)測(cè)大鼠Actc1基因5’上游序列轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)獲取A

11、ctc1基因5’上游1500bp序列信息(http：//www.ensembl.org)，應(yīng)用P-MATCH軟件預(yù)測(cè)其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　 (3)熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)PCR擴(kuò)增Actc1基因啟動(dòng)子序列，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體pGL4-Actc1。pGL4-Actc1和pcDNA-NKX2.5轉(zhuǎn)染COS7及H9C2細(xì)胞，觀察NKX2.5對(duì)Actc1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　 (4)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)E12.5d胎鼠心肌組織核蛋白和

12、3’生物素標(biāo)記的探針在凝膠阻滯緩沖液中室溫結(jié)合1小時(shí)，10％的聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、紫外交聯(lián)后，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果。
　　 (5)染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)提取E12.5d胎鼠心肌組織染色質(zhì)，甲醛交聯(lián)、酶切后應(yīng)用NKX2.5抗體沉淀，沉淀下的染色質(zhì)通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果。
　　 結(jié)果：
　　 1、33例CHD心肌組織標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)ACTC1基因編碼區(qū)突變，但存在ACTC1基因表達(dá)下調(diào)(26/33，78.8％)

13、。
　　 2、CHD患者心肌標(biāo)本TUNEL陽(yáng)性心肌細(xì)胞凋亡率增加，Caspase-3表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)。
　　 3、轉(zhuǎn)染Actc1-siRNA后，TUNEL/AnnexinV陽(yáng)性。H9C2細(xì)胞數(shù)增加；Caspase-3表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)。
　　 4、在E12.5d胎鼠心臟中NKX2.5和ACTC1分別表達(dá)于心肌細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中。
　　 5、在大鼠Actc1基因啟動(dòng)子區(qū)域(-1066)存

14、在NKX2.5的可能結(jié)合位點(diǎn)。
　　 6、外源表達(dá)NKX2.5可明顯激活大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2中Actc1基因表達(dá)。
　　 7、NKX2.5通過(guò)與NKX2.5結(jié)合位點(diǎn)(-1066)結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　 8、在體外NKX2.5蛋白可以和Actc1基因啟動(dòng)子區(qū)位點(diǎn)(-1066)直接結(jié)合。
　　 9、在E12.5d大鼠胚胎心臟發(fā)育過(guò)程中NKX2.5可以和Actc1基因啟動(dòng)子區(qū)NKX2.5結(jié)合位點(diǎn)(-1