海洋亞硫酸桿菌M44的鑒定及代謝產(chǎn)物研究.pdf

1、本課題采用的實(shí)驗(yàn)菌株M44是從中國東海（東經(jīng)122.8°，北緯30.9°）海水中分離得到的一株低嗜鹽菌，最適生長鹽度為2.5％，經(jīng)MTT 法篩選表明，菌株M44 發(fā)酵液對HL-60、HepG2、SW1990細(xì)胞株均有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。對菌株M44 產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物的熱及酸、堿穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，發(fā)酵液中活性物質(zhì)對熱反應(yīng)比較穩(wěn)定，90℃處理30min后細(xì)胞毒活性基本不變，但發(fā)酵液在pH 3.0和pH 11.0條件下處理2 h后調(diào)回其原始

2、pH，細(xì)胞毒活性基本喪失。通過抽提菌株M44的總DNA 模板，PCR 擴(kuò)增16S rDNA 序列，Blast 比對并構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果顯示其與亞硫酸桿菌（Sulfitobacter dubius）的進(jìn)化位置最為接近，它們的相似度高達(dá)99％。該菌革蘭染色、培養(yǎng)特征、生長特性、部分生理生化特征、胞壁脂肪酸組分、基因組G+C％等研究也顯示該菌株具有亞硫酸桿菌的特征，因此鑒定其為亞硫酸桿菌。在對菌株M44的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后，得到其最佳搖瓶發(fā)酵條

3、件為：溫度25 ℃、初始pH 7.0、裝液量 50mL/250mL、接種量 4％。在此條件下培養(yǎng)的發(fā)酵液其細(xì)胞毒活性最強(qiáng)。小量發(fā)酵后的發(fā)酵液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等體積萃取，分別測定其對HL-60、HepG2、SW1990細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)活性成分分布在乙酸乙酯萃取部分中，為中等極性物質(zhì)。搖瓶大規(guī)模發(fā)酵得菌液60L，離心除菌體后，上清用等體積乙酸乙酯充分萃取三次，減壓蒸干，最后得到乙酸乙酯浸膏5 g。通過ODSC-18

4、 柱層析、Sephadex LH-20凝膠層析以及RP-HPLC等各種色譜技術(shù)，對M44 產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，共得到了25個(gè)單體化合物。利用P1PH-NMR、P13PC-NMR、EI-MS、等波譜技術(shù)并結(jié)合化合物的理化性質(zhì)確定了其中6個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)。它們分別是：分別為Ⅰ、環(huán)（纈氨酸-亮氨酸）；Ⅱ、環(huán)（苯丙-纈氨酸）；Ⅲ、環(huán)（苯丙-亮氨酸）；Ⅳ、環(huán)（亮-異亮氨酸）；Ⅴ、環(huán)（苯丙-異亮氨酸）；Ⅵ、環(huán)（色-脯氨酸）?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)如

5、下：化合物的活性測定結(jié)果表明：環(huán)（亮-異亮氨酸）對HepG2和Hep2細(xì)胞株均表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒活性，其ICB50B分別為118 μg/mL和135 μg/mL，其余各單體化合物對4種腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性均不明顯；分離得到的化合物對大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌的抗菌活性均不明顯，且對菌株M44 產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的影響也不明顯。綜上所述，本工作主要針對海洋亞硫酸桿菌M44及其生物活性物質(zhì)進(jìn)行了初步的研究，并分離得到了6個(gè)環(huán)二肽結(jié)構(gòu)