生姜種質(zhì)資源倍性分析及離體誘變與細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)研究.pdf

1、生姜(Zingiber officinale roscoe)為姜科（Zingiberaceae）多年生草本植物，以地下肥大的肉質(zhì)根莖為食用器官。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)，我國是世界上生姜栽培面積最大，生產(chǎn)總量最多的國家。近年來，隨著生姜國際貿(mào)易量的增加，對(duì)生姜品種的經(jīng)濟(jì)性狀提出了更高的要求，加快生姜新品種選育至關(guān)重要。生姜是無性繁殖作物，通過傳統(tǒng)有性雜交手段進(jìn)行新品種選育較難，主要采用對(duì)自然變異選擇及利用誘變技術(shù)和生物技術(shù)等手段開

2、展新品種選育。由于種質(zhì)資源染色體倍性數(shù)據(jù)是新品種選育必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和遺傳背景，但關(guān)于生姜種質(zhì)資源倍性分析方面研究較少，因此本研究在對(duì)生姜種質(zhì)資源的染色體倍性和染色體基數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)地分析基礎(chǔ)上，構(gòu)建不同倍性生姜芽尖快繁技術(shù)體系，開展生姜染色體誘變技術(shù)研究，建立生姜細(xì)胞懸浮系等生物育種技術(shù)體系，可為創(chuàng)新生姜種質(zhì)材料和新品種的選育提供有力的保證。主要結(jié)果如下:
　　1.采用流式細(xì)胞儀對(duì)來自中國各地63份生姜種質(zhì)資源進(jìn)行倍性分析，結(jié)果表明，

3、16個(gè)生姜品種（占總種質(zhì)資源25.4％）為二倍-四倍混倍體生姜，其中四倍體細(xì)胞比率均大于40％，47個(gè)生姜品種（占總種質(zhì)資源74.6％）為二倍體，沒有四倍體或更高倍性生姜自然發(fā)生，但生姜種質(zhì)資源中二倍-四倍混倍體的自然發(fā)生為首次發(fā)現(xiàn)。同時(shí)采用根尖壓片法對(duì)所有生姜種質(zhì)資源染色體數(shù)目進(jìn)行分析，結(jié)果表明，中國地區(qū)生姜基本染色體數(shù)為x=11。生姜的表型性狀隨著倍性不同而發(fā)生改變，二倍體生姜和混倍體生姜植株之間存在顯著形態(tài)學(xué)差異，混倍體生姜莖粗較

4、粗，分枝數(shù)和姜球數(shù)較少，單球重和單株根莖鮮重較大，為“大姜類型”生姜;二倍體生姜莖粗較細(xì)，分枝數(shù)和姜球數(shù)較多，單球重和單株根莖鮮重較小，為“小姜類型”生姜。同時(shí)分別通過對(duì)不同倍性之間的差異表型性狀進(jìn)行聚類分析，最終確定生姜單球重為區(qū)分二倍體生姜和混倍體生姜最關(guān)鍵的植物學(xué)性狀。
　　2.不同激素配比顯著影響不同倍性生姜離體芽尖接種成活率、初代接種芽尖增殖系數(shù)以及繼代增值系數(shù)和試管苗植株株高。當(dāng)NAA0.4 mg·L-1與KT2.5

5、mg·L-1時(shí)，混倍體生姜“山農(nóng)1號(hào)”的莖尖成活率較高，為73.5％，且此激素濃度配比時(shí)，繼代增殖系數(shù)也較大，為5.8，株高為7.2cm;二倍體生姜“廣西小黃姜”適宜初代培養(yǎng)基激素配比與繼代培養(yǎng)基也較為一致，為NAA0.2 mg·L-1、KT1.5 mg·L-1。采用ISSR分子標(biāo)記方法檢測(cè)不同倍性生姜離體快繁中不同繼代次數(shù)的試管苗、馴化苗以及大田苗（母本）的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果表明，“山農(nóng)1號(hào)”和“廣西小黃姜”擴(kuò)增片段長(zhǎng)度均在200～20

6、00 bp，其中“山農(nóng)1號(hào)”共獲得清晰可見帶60條，平均每個(gè)引物代數(shù)大約6條;“廣西小黃姜”共獲得清晰可見的帶43條，平均每個(gè)引物代數(shù)大約為4條（表6）。通過比較和分析不同引物的電泳圖得出，“山農(nóng)1號(hào)”和“廣西小黃姜”的不同繼代次數(shù)試管苗、馴化苗與大田苗相比，ISSR引物擴(kuò)增譜帶無異，表明在所檢測(cè)范圍內(nèi)不同倍性生姜離體快繁時(shí)DNA水平上未發(fā)生變異，遺傳穩(wěn)定性好。同時(shí)也通過流式細(xì)胞儀確定，無論混倍體還是二倍體生姜，通過莖尖離體培養(yǎng)長(zhǎng)期保存

7、后，其DNA含量比較穩(wěn)定，倍性一致，且不同倍性生姜的馴化移栽苗與大田苗的植株形態(tài)性狀也無明顯變異，如“山農(nóng)1號(hào)”大田苗的根莖鮮重為1452.0g，馴化苗為1435.3g，兩者之間無顯著差異。
　　3.以混倍體生姜“山農(nóng)1號(hào)”為試材，通過秋水仙素誘導(dǎo)可產(chǎn)生二倍體和四倍體生姜，且秋水仙素處理濃度和誘導(dǎo)時(shí)間可顯著影響誘導(dǎo)效果，在附加秋水仙素濃度為0.15％時(shí)，處理時(shí)間為12h～16h時(shí)，生姜莖段的成活率高于80％，植株變異率高于25％。

8、與混倍體植株（對(duì)照）相比，二倍體生姜株高較矮，莖粗較細(xì)，葉片較薄，如二倍體生姜的株高、莖粗和葉厚分別比對(duì)照低30.3％，10.5％和27.3％。秋水仙素誘變產(chǎn)生兩個(gè)四倍體表型，表型Ⅰ株高、莖粗、葉長(zhǎng)、葉寬和葉厚分別較對(duì)照低47.0％，42.1％，28.6％，26.7％和40.5％;而四倍體表型Ⅱ各指標(biāo)均較對(duì)照高于7.6％、13.2％、34.3％、60.0％和35.7％。
　　4.混倍體生姜（對(duì)照）和誘導(dǎo)產(chǎn)生的二倍體生姜繼代時(shí)植株成

9、活率較高，倍性穩(wěn)定。但四倍體生姜隨著繼代次數(shù)增加成活率顯著降低，第10次繼代時(shí)，表型Ⅰ的植株成活率已低至為0，而表型Ⅱ僅為1.5％，且表型Ⅱ倍性易改變，第7代繼代時(shí)，就會(huì)有17.9％的二倍體植株出現(xiàn)。不同倍性生姜試管苗馴化移栽時(shí)，成活率不同，移栽后植株長(zhǎng)勢(shì)也不同。對(duì)照和二倍體生姜移栽成活率可達(dá)100％，生長(zhǎng)較快，而四倍體試管苗的移栽成活率較低，生長(zhǎng)緩慢，長(zhǎng)勢(shì)較弱，且隨著生長(zhǎng)的進(jìn)行，移栽植株陸續(xù)發(fā)生死亡，移栽后120d時(shí)，四倍體Ⅰ型和Ⅱ型

10、植株成活率為44.0％和28.0％，但移栽后180d時(shí)，四倍體兩種表型成活率均為0。可見，四倍體可能是生姜不能穩(wěn)定存在的倍性類型。
　　5.以“萊蕪大姜”試管苗葉片為外植體，接種到MS+1.0 mg·L-12，4-D+0.5 mg· L-16-BA+30 g-L-1蔗糖的培養(yǎng)基上，可有效誘導(dǎo)出生長(zhǎng)迅速、質(zhì)地疏松的愈傷組織。將獲得的愈傷組織接種到MS+0.15 mg·L-12，4-D+6.0 mg· L-16-BA+30g· L-1