植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)

1、植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)一、基本原理利用固體瓊脂培養(yǎng)基對植物的離體組織進(jìn)行培養(yǎng)的方法在某些方面還存在一些缺點(diǎn)，比如在培養(yǎng)過程中，植物的愈傷組織在生長過程中的營養(yǎng)成分、植物組織產(chǎn)生的代謝物質(zhì)呈現(xiàn)一個梯度分布，而且瓊脂本身也有一些不明的物質(zhì)成分可能對培養(yǎng)物產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致植物組織生長發(fā)育過程中代謝的改變而利用液體培養(yǎng)基則可以克服這一缺點(diǎn)，當(dāng)植物的組織在液體培養(yǎng)基中生長時，我們可以通過薄層震蕩培養(yǎng)或向培養(yǎng)基中通氣用以改善培養(yǎng)基中氧氣的供應(yīng)。植物

2、細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)是指將植物細(xì)胞或較小的細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中能夠保持良好的分散狀態(tài)。這些小的細(xì)胞聚合體通常來自植物的愈傷組織。一般的操作過程是把未分化的愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中不斷進(jìn)行旋轉(zhuǎn)震蕩，一般可用100～12min的速度進(jìn)行。由于液體培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)和震蕩，使得愈傷組織上分裂的細(xì)胞不斷游離下來。在液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物是混雜的，既有游離的單個細(xì)胞，也有較大的細(xì)胞團(tuán)塊，還有接種物的死細(xì)胞殘?jiān)?/p>

3、在液體懸浮培養(yǎng)過程中應(yīng)注意及時進(jìn)行細(xì)胞繼代培養(yǎng)，因?yàn)楫?dāng)培養(yǎng)物生長到一定時期將進(jìn)入分裂的靜止期。對于多數(shù)懸浮培養(yǎng)物來說，細(xì)胞在培養(yǎng)到第18～25d時達(dá)到最大的密度，此時應(yīng)進(jìn)行第一次繼代培養(yǎng)。在繼代培養(yǎng)時，應(yīng)將較大的細(xì)胞團(tuán)塊和接種物殘?jiān)?。若從植物器官或組織開始建立細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，就包括愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)、單細(xì)胞分離和懸浮培養(yǎng)。目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的形態(tài)、生理、遺傳、凋亡等研究工作，特別是為基因工程在植物細(xì)胞水平上的操作

4、提供了理想的材料和途徑。經(jīng)過轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再經(jīng)過誘導(dǎo)分化形成植株，即可獲得攜帶有目標(biāo)基因的個體。二、器材超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱、磁力攪拌器、恒溫空氣搖床、鑷子、錐形瓶、水稻種子三、操作步驟1配制培養(yǎng)基按照培養(yǎng)基配方取各種藥品，最后用蒸餾水定容到所需體積。所配制的培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌后備用，固體瓊脂培養(yǎng)基分裝在250mL的錐形瓶內(nèi)，每瓶約分裝30mL。2水稻種子的消毒（1）將種子置于無菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，以體積分?jǐn)?shù)95％的酒精消

5、毒1～2min。（2）取出后用無菌水沖洗2～3遍。（3）將種子放入25.0gL的次氯酸鈉溶液中輕輕搖動后，浸泡60min。（4）取出后用無菌水沖洗，將次氯酸鈉溶液充分洗凈。3.接種在超凈工作臺內(nèi)，將滅菌后的水稻種子接到誘導(dǎo)愈傷組織的固體培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)瓶接5～10粒種子。接種完畢后用封口膜將培養(yǎng)瓶封好，放在26℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)。4懸浮培養(yǎng)的開始：當(dāng)?shù)玫接鷤M織后，將其轉(zhuǎn)人到AA液體培養(yǎng)基中。注意愈傷組織塊應(yīng)小于3mm.若組

6、織塊較大可用無菌解剖刀將其分割成小塊。液體培養(yǎng)基分裝在250mL的錐形瓶內(nèi)接種完畢后將瓶口用封口膜封好，把培養(yǎng)瓶放到恒溫?fù)u床上進(jìn)行震蕩培養(yǎng)。調(diào)整搖床的旋轉(zhuǎn)速度，使之為120rmin。培養(yǎng)溫度為26℃，在黑暗中培養(yǎng)。5懸浮培養(yǎng)物的保持進(jìn)行懸浮培養(yǎng)后要不斷進(jìn)行觀察，由于培養(yǎng)物的繼代培養(yǎng)與培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)物的密度及細(xì)胞生長速度有關(guān)，因此當(dāng)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)物密度較大時，應(yīng)及時用無菌的吸管吸取部分培養(yǎng)物到一新的50mL培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。同時還要及時淘

7、汰一些大的組織團(tuán)塊和黃褐色的壞死組織。一般每隔4～7d就要繼代一次。植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物組織培養(yǎng)技術(shù)2011050819:21第五章第五章細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)教學(xué)目的：掌握植物單細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法和技術(shù)，熟悉細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素，了解細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用。教學(xué)目的：掌握植物單細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法和技術(shù)，熟悉細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素，了解細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用。教學(xué)重點(diǎn)：教學(xué)重點(diǎn)：1、單細(xì)胞培養(yǎng)的方法與技術(shù)；、單細(xì)胞培養(yǎng)的方法與技術(shù)；2、細(xì)胞懸浮

8、培養(yǎng)的方法與技術(shù)；、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法與技術(shù)；3、懸浮細(xì)胞的同步化技術(shù)。、懸浮細(xì)胞的同步化技術(shù)。教學(xué)難點(diǎn)：細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素及其生長調(diào)控。教學(xué)難點(diǎn)：細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素及其生長調(diào)控。教學(xué)內(nèi)容：教學(xué)內(nèi)容：1、植物細(xì)胞培養(yǎng)：指在離體條件下對植物單個細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行培養(yǎng)使其繁殖的技術(shù)。、植物細(xì)胞培養(yǎng)：指在離體條件下對植物單個細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行培養(yǎng)使其繁殖的技術(shù)。2、植物細(xì)胞培養(yǎng)的類型：、植物細(xì)胞培養(yǎng)的類型：（1）根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模：分為小規(guī)模培

9、養(yǎng)和大批量培養(yǎng)；）根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模：分為小規(guī)模培養(yǎng)和大批量培養(yǎng)；（2）根據(jù)培養(yǎng)方式：分為懸浮培養(yǎng)、平板培養(yǎng)和看護(hù)培養(yǎng)；）根據(jù)培養(yǎng)方式：分為懸浮培養(yǎng)、平板培養(yǎng)和看護(hù)培養(yǎng)；（3）根據(jù)要求的產(chǎn)物不同：分為誘變的細(xì)胞培養(yǎng)和生產(chǎn)次生代謝物的細(xì)胞培養(yǎng)。）根據(jù)要求的產(chǎn)物不同：分為誘變的細(xì)胞培養(yǎng)和生產(chǎn)次生代謝物的細(xì)胞培養(yǎng)。第二節(jié)第二節(jié)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)一、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)：一、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)：1、概念：指將單個游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增

10、殖的技術(shù)。、概念：指將單個游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。2、意義：、意義：①在液體狀態(tài)下便于細(xì)胞和營養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸和交換；在液體狀態(tài)下便于細(xì)胞和營養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸和交換；②細(xì)胞狀態(tài)可相對保持一致，利于進(jìn)行各種遺傳操作和生理生化活動的研究。細(xì)胞狀態(tài)可相對保持一致，利于進(jìn)行各種遺傳操作和生理生化活動的研究。③為植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)提供前期技術(shù)基礎(chǔ)。為植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)提供前期技術(shù)基礎(chǔ)。3、內(nèi)容：、內(nèi)容：①小細(xì)胞

11、團(tuán)培養(yǎng)；小細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)；②單細(xì)胞培養(yǎng)；單細(xì)胞培養(yǎng)；③原生質(zhì)體培養(yǎng)。原生質(zhì)體培養(yǎng)。二、懸浮培養(yǎng)的啟動：二、懸浮培養(yǎng)的啟動：1、種子細(xì)胞懸浮系的要求：細(xì)胞增殖速度快、有用成分含量高、分散程度大、再生能力強(qiáng)。、種子細(xì)胞懸浮系的要求：細(xì)胞增殖速度快、有用成分含量高、分散程度大、再生能力強(qiáng)。2、優(yōu)良細(xì)胞株系的篩選方法：、優(yōu)良細(xì)胞株系的篩選方法：①從已經(jīng)建立的愈傷組織中挑選出外觀疏松、生長較快、胚胎發(fā)生能力強(qiáng)的淡色愈傷組織；從已經(jīng)建立的愈傷組織中挑選

12、出外觀疏松、生長較快、胚胎發(fā)生能力強(qiáng)的淡色愈傷組織；②采用振蕩培養(yǎng)或酶解法得到更好的單細(xì)胞系或小細(xì)胞團(tuán)；采用振蕩培養(yǎng)或酶解法得到更好的單細(xì)胞系或小細(xì)胞團(tuán)；③培養(yǎng)后單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)擱在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)后單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)擱在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；④挑選生長較快、生長良好的細(xì)胞株進(jìn)行繼代培養(yǎng)；挑選生長較快、生長良好的細(xì)胞株進(jìn)行繼代培養(yǎng)；⑤挑選各細(xì)胞系的培養(yǎng)物進(jìn)行有效成分測定，篩選有效成分高而生長較快的細(xì)胞株作為種子細(xì)胞。挑選各細(xì)胞系

13、的培養(yǎng)物進(jìn)行有效成分測定，篩選有效成分高而生長較快的細(xì)胞株作為種子細(xì)胞。三、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法：三、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法：（一）分批培養(yǎng)：（一）分批培養(yǎng)：1、分批培養(yǎng)：指在一個封閉的系統(tǒng)中進(jìn)行的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，僅氣體和揮發(fā)性代謝產(chǎn)物可同外界空氣交換。、分批培養(yǎng)：指在一個封閉的系統(tǒng)中進(jìn)行的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，僅氣體和揮發(fā)性代謝產(chǎn)物可同外界空氣交換。2、懸浮細(xì)胞的生長：細(xì)胞數(shù)量隨著培養(yǎng)時間的變化，其擴(kuò)增生長呈、懸浮細(xì)胞的生長：細(xì)胞數(shù)量隨著培養(yǎng)時間的變

14、化，其擴(kuò)增生長呈S形曲線，包括停滯期、對數(shù)生長期、直線生長期、減慢形曲線，包括停滯期、對數(shù)生長期、直線生長期、減慢期和停止期期和停止期5個時期。個時期。注：注：①通過縮短繼代的時間或是經(jīng)過一些其他的處理使懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞始終處在對數(shù)生長期；通過縮短繼代的時間或是經(jīng)過一些其他的處理使懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞始終處在對數(shù)生長期；②加入條件培養(yǎng)基可以縮短停滯期的時間，使懸浮細(xì)胞快速恢復(fù)生長。加入條件培養(yǎng)基可以縮短停滯期的時間，使懸浮細(xì)胞快速恢復(fù)生長。3、

15、分批培養(yǎng)的方法：、分批培養(yǎng)的方法：①旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)：培養(yǎng)容器呈旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)：培養(yǎng)容器呈360360旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速②往返振蕩培養(yǎng)：培養(yǎng)容器在一個方向上往返振蕩；往返振蕩培養(yǎng)：培養(yǎng)容器在一個方向上往返振蕩；③旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)：培養(yǎng)物在一個平面上進(jìn)行旋轉(zhuǎn)振蕩，轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)：培養(yǎng)物在一個平面上進(jìn)行旋轉(zhuǎn)振蕩，轉(zhuǎn)速40120rmin40120rmin，如搖床培養(yǎng)；，如搖床培養(yǎng)；④攪動培養(yǎng)：培養(yǎng)物在攪棒的攪動下進(jìn)行的培養(yǎng)。攪動培養(yǎng)：培養(yǎng)物在攪棒的攪動下進(jìn)

16、行的培養(yǎng)。4、分批培養(yǎng)的特點(diǎn)：細(xì)胞生長和培養(yǎng)基的成分都在不斷地變化，對細(xì)胞生長和代謝的研究不利。、分批培養(yǎng)的特點(diǎn)：細(xì)胞生長和培養(yǎng)基的成分都在不斷地變化，對細(xì)胞生長和代謝的研究不利。（二）半連續(xù)培養(yǎng)：（二）半連續(xù)培養(yǎng)：1、指在培養(yǎng)容器中接種細(xì)胞并培養(yǎng)一段時間后，將部分培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)進(jìn)行交換的一種培養(yǎng)方法。、指在培養(yǎng)容器中接種細(xì)胞并培養(yǎng)一段時間后，將部分培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)進(jìn)行交換的一種培養(yǎng)方法。2、半連續(xù)培養(yǎng)的特點(diǎn)：、半連續(xù)培養(yǎng)的特點(diǎn)：①培