玉米大斑病菌StFPS1參與病菌高滲脅迫及細(xì)胞壁發(fā)育機(jī)制初探.pdf

1、本課題組在前期研究中利用生物信息學(xué)手段初步明確了在玉米大斑病菌中存在4條MAPK級聯(lián)途徑，其中HOG-MAPK途徑主要參與調(diào)控病菌的高滲脅迫反應(yīng)。繼而，克隆了玉米大斑病菌水甘油通道蛋白基因StFPS1，并利用RNAi及基因敲除技術(shù)初步闡明了基因的功能。本研究在此基礎(chǔ)上，利用基因敲除技術(shù)再次創(chuàng)制StFPS1基因的2株敲除突變體，通過比較突變體與野生型菌株在生長發(fā)育、細(xì)胞壁發(fā)育及對高滲脅迫的反應(yīng)，進(jìn)一步明確該基因的功能。主要研究結(jié)果如下:<

2、br>　　1、獲得了玉米大斑病菌StFPS1基因敲除突變體。驗(yàn)證了前期研究中構(gòu)建的玉米大斑病菌StFPS1基因敲除載體，并將該載體轉(zhuǎn)化玉米大斑病菌野生型菌株原生質(zhì)體;利用潮霉素抗性篩選獲得了2株表型穩(wěn)定的抗性轉(zhuǎn)化子;通過特異引物PCR、RT-PCR等技術(shù)證實(shí)了這2株抗性轉(zhuǎn)化子為StFPS1基因敲除突變體。
　　2、StFPS1基因影響玉米大斑病菌菌絲細(xì)胞的形態(tài)建成及分生孢子發(fā)育。與野生型菌株相比，StFPS1基因敲除突變體在PDA

3、培養(yǎng)基上生長速度降低，菌絲細(xì)胞長度增加并出現(xiàn)彎曲膨大現(xiàn)象，幾乎不產(chǎn)生分生孢子。表明，StFPS1基因不僅影響菌絲發(fā)育，也影響分生孢子發(fā)育。
　　3、StFPS1基因參與玉米大斑病菌菌絲細(xì)胞的高滲脅迫反應(yīng)。在高滲脅迫條件下，與野生型菌株相比，突變體菌絲細(xì)胞膨大;菌絲細(xì)胞內(nèi)甘油含量顯著增加;生長速率受抑制程度低，StFPS1基因敲除突變體對高滲脅迫條件的耐受力明顯提高。表明，StFPS1基因參與病菌高滲脅迫反應(yīng)，是一種調(diào)控因子。進(jìn)一步

4、檢測外高滲脅迫條件下突變菌株中調(diào)控甘油合成的關(guān)鍵基因（StGPD1、StHOR2）的表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)2個(gè)基因的表達(dá)水平比正常培養(yǎng)條件下升高，但未達(dá)到野生型菌株中基因的表達(dá)水平?；诖耍茰y玉米大斑病菌中水甘油通道蛋白StFPS1的缺失、甘油的外排受阻是細(xì)胞甘油含量升高及突變體提高其耐受高滲脅迫條件的主要原因。
　　4、透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，StFPS1基因敲除突變體的細(xì)胞壁明顯變薄;Real-time RCR技術(shù)分

5、析發(fā)現(xiàn)突變體中細(xì)胞壁合成相關(guān)基因StCHS1、StCHS2、StCHS2、StRho1的表達(dá)量均降低，且突變體對細(xì)胞壁合成干擾物質(zhì)的敏感性降低。結(jié)果表明，StFPS1基因參與調(diào)控病菌細(xì)胞壁的形態(tài)建成。
　　5、滲脅迫條件下，野生型和突變體菌株細(xì)胞壁均增厚，但突變體顯著增厚。細(xì)胞壁合成基因（StC HS1、StCHS2、StCHS3、StRho1)表達(dá)水平明顯增加，表明在高滲脅迫條件下，細(xì)胞壁增厚是病菌耐受高滲脅迫條件的重要反應(yīng)之一

6、。
　　6、玉米大斑病菌StFPS1基因?qū)OG-MAPK途徑和CWI-MAPK級聯(lián)途徑均具有一定影響。本研究發(fā)現(xiàn)在StFPS1基因敲除突變體中HOG-MAPK和CWI-MAPK途徑的關(guān)鍵基因StHOG1、StSLT2表達(dá)量均呈現(xiàn)顯著下降。因此，StFPS1基因的缺失降低了StHOG1、StSLT2基因的表達(dá)水平，降低了細(xì)胞壁合成酶基因的表達(dá)水平，是細(xì)胞壁合成受阻，是胞壁變薄。
　　7、玉米大斑病菌StFPS1基因參與病菌的