KLF5在DCA介導(dǎo)下誘導(dǎo)食管鱗狀上皮向柱狀上皮轉(zhuǎn)分化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　Barrett食管（Barrett's esophagus，簡稱BE）是指遠(yuǎn)端食管鱗狀上皮被化生的柱狀上皮所取代的病理現(xiàn)象，是食管腺癌重要的癌前病變。由于BE具有易癌變的特性，使其在臨床受到高度重視并成為研究食管腺癌的主要對象。雖然BE于19世紀(jì)50年代已在病理學(xué)上被定義、19世紀(jì)70年代已經(jīng)被認(rèn)為是食管腺癌的形成因素，但對于引起B(yǎng)arrett食管的分子機(jī)制，我們的了解仍然非常有限。
　　臨床觀察表明，多數(shù)食管腺

2、癌的發(fā)生經(jīng)歷了胃食管反流(GERD)、BE至食管腺癌的系列演變過程。研究認(rèn)為胃食管反流物的刺激導(dǎo)致BE的發(fā)生，胃酸與膽鹽是反流物的主要成分，以往研究認(rèn)為胃酸與GERD、BE的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，而膽鹽在BE發(fā)生中的作用仍未引起足夠的重視。近期研究發(fā)現(xiàn)，膽鹽在BE相關(guān)腺癌的發(fā)病過程中起重要作用，但膽鹽引起B(yǎng)E發(fā)生的機(jī)制仍未完全明了。
　　KLF5(Krüppel-like factor5)是一種鋅指蛋白，屬于Sp/KLF蛋白家族，高表

3、達(dá)于腸道上皮細(xì)胞，是維持成人小腸的隱窩-絨毛軸所必需的因子，小腸絨毛的形成有賴于KLF5的調(diào)控;黏蛋白2(MUC2)大量表達(dá)于杯狀細(xì)胞，被認(rèn)為是杯狀細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，MUC2也可在臨床病理診斷中作為Barrett食管杯狀細(xì)胞的分子標(biāo)志;CDX2是一種核轉(zhuǎn)錄因子，在腸道上皮的生長、增殖以及分化過程中具有重要作用，它也是Barrett食管特征性表達(dá)因子之一;已有研究表明，膽酸能上調(diào)正常食管細(xì)胞系中腸化標(biāo)志物CDX2和杯狀細(xì)胞標(biāo)志物MUC2

4、表達(dá)。小腸絨毛標(biāo)志物VILLIN是一種肌動蛋白粘連蛋白，特異性表達(dá)于小腸絨毛刷狀緣;研究發(fā)現(xiàn)VILLIN在BE及食管腺癌病組織表達(dá)量較高。所以，MUC2、CDX2、VILLIN等腸道重要標(biāo)志物都與Barrett食管的形成相關(guān)，而KLF5可以促進(jìn)小腸的生長發(fā)育、調(diào)控小腸絨毛的形成，與MUC2、CDX2及VILLIN等腸道標(biāo)志物密切相關(guān);但KLF5是否通過調(diào)控上述腸道標(biāo)志物介導(dǎo)BE組織形成，迄今尚無研究報道。
　　本課題采集正常人群、

5、臨床診斷食管炎、BE人群食管組織標(biāo)本，并構(gòu)建大鼠食管炎及Barrett食管動物模型，進(jìn)行免疫組化實驗，旨在探討KLF5是否與Barrett食管相關(guān);用DCA處理食管鱗狀上皮細(xì)胞株HET-1a細(xì)胞模擬體外反流實驗，探討KLF5是否參與腸化的形成過程;干擾及過表達(dá)正常食管細(xì)胞中KLF5，探討KLF5對MUC2、CDX2及VILLIN等腸化標(biāo)志物的調(diào)節(jié)作用。揭示了在DCA誘導(dǎo)下KLF5可以通過調(diào)節(jié)MUC2、CDX2及VILLIN等因子的表達(dá)，

6、導(dǎo)致食管鱗狀上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為柱狀上皮表型。
　　方法：
　　1.飼養(yǎng)Sprague-Dawley(SD)大鼠，并施以外科手術(shù)構(gòu)建膽酸反流模型，取其食管組織，制成免疫組化切片;
　　2.收集第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年3月至2013年12月的反流性食管炎(RE)標(biāo)本59例，短段BE標(biāo)本21例;
　　3.免疫組化檢測人和老鼠的食管鱗狀上皮、食管炎及BE組織中KLF5、MUC2、VILLIN、CDX2在組織中蛋白

7、表達(dá)水平;
　　4.培養(yǎng)人食管鱗狀上皮細(xì)胞(HET-1a)，用濃度為200umol/L的去氧膽酸(DCA)按不同時間點(diǎn)處理HET-1a細(xì)胞，分別為0h、2h、4h、8h、12h;
　　5.Real-time PCR（實時熒光定量PCR）、Western blot檢測DCA處理后，各時間點(diǎn)HET-1a細(xì)胞內(nèi)KLF5、VILLIN、 MUC2及CDX2的mRNA及蛋白表達(dá)水平;
　　6.下調(diào)KLF5后，Real-time

8、PCR(實時熒光定量PCR)、Western blot檢測細(xì)胞中KLF5、MUC2、CDX2及VILLIN的mRNA及蛋白水平表達(dá)情況;
　　7.過表達(dá)KLF5，采用Real-time PCR、Western blot檢測在細(xì)胞內(nèi)KLF5、VILLIN、MUC2及CDX2的mRNA及蛋白表達(dá)水平;
　　8.免疫熒光檢測上述處理后HET-1a細(xì)胞內(nèi)KLF5、VILLIN、MUC2及CDX2的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：

9、r>　　1.免疫組化結(jié)果顯示，在人類及大鼠BE食管上皮組織中KLF5、VILLIN、MUC2、及CDX2的表達(dá)呈強(qiáng)陽性，在食管炎中表達(dá)呈弱陽性或不表達(dá)，而在正常食管中表達(dá)呈陰性;
　　2.HET-1a細(xì)胞經(jīng)DCA處理后，Real-time及Western blot檢驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比隨著處理時間的延長，KLF5、VILLIN、MUC2、及CDX2的mRNA及蛋白水平的表達(dá)也呈上升趨勢;
　　3.siRNA干擾細(xì)胞后，Rea

10、l-time及Western blot檢驗發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比食管鱗狀上皮細(xì)胞中VILLIN、MUC2、及CDX2的mRNA及蛋白表達(dá)受到抑制，且對DCA誘導(dǎo)上述因子的表達(dá)也有明顯的抑制作用;
　　4.慢病毒過表達(dá)KLF5后，Real-time及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)腸道標(biāo)志物VILLIN、MUC2、及CDX2的mRNA及蛋白與陰性對照相比表達(dá)也明顯增加。
　　5.經(jīng)過上述1，2，3，4相同處理因素后，免疫熒光實

11、驗檢測HET-1a細(xì)胞內(nèi)KLF5、MUC2、CDX2、VILLIN的蛋白表達(dá)趨勢，檢測結(jié)果與上述實驗結(jié)果一致。
　　結(jié)論：
　　1.KLF5在大鼠和人BE組織中的表達(dá)明顯高于食管炎癥以及正常組織，說明KLF5與Barrett食管相關(guān)。
　　2.DCA處理HET-1a細(xì)胞后，隨著處理時間的延長，KLF5以及MUC2、CDX2以及VILLIN的腸道標(biāo)志物的表達(dá)明顯增加，這在細(xì)胞實驗上進(jìn)一步證明了KLF5與Barrett食管

12、的形成相關(guān)，且DCA能誘導(dǎo)KLF5、MUC2、CDX2、VILLIN的表達(dá)。
　　3.抑制HET-1a細(xì)胞內(nèi)KLF5的表達(dá)，MUC2、CDX2以及VILLIN表達(dá)也明顯下調(diào)，說明KLF5可能位于它們的上游，并能調(diào)控它們的表達(dá)。
　　4.上調(diào)HET-1a細(xì)胞內(nèi)KLF5的表達(dá)發(fā)現(xiàn)MUC2、CDX2以及VILLIN表達(dá)明顯增高，說明KLF5能夠誘導(dǎo)上述因子的表達(dá)。
　　以上發(fā)現(xiàn)提示，KLF5在DCA的介導(dǎo)下可誘導(dǎo)CDX2、M