血清反應因子在糖尿病腎病上皮間質轉分化中的作用及相關機制.pdf

1、研究背景與研究目的:
　　糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)在糖尿病患者中的患病率大約為20％～40％，是糖尿病的重要并發(fā)癥和主要死亡原因。近年來隨著糖尿病患者人數(shù)的快速增長，DN的發(fā)病率逐年上升，在一些國家或地區(qū)已經成為終末期腎病(ESRD)的首位原因。DN的發(fā)病機制極為復雜，其確切機制尚未明確，多種因素通過各自作用以及相互交叉作用共同導致DN的發(fā)生和發(fā)展。對DN發(fā)病機制更深一步的研究，將對發(fā)掘DN有效

2、的預防和治療方法產生深遠而重要的意義。
　　足細胞是腎小球濾過膜極其重要的組成部分，其電荷屏障作用是阻止蛋白質漏出的關鍵。DN時足細胞發(fā)生EMT，足突融合、消失，隨后發(fā)生陰離子電荷減少、微絨毛形成、體積縮小，足細胞最終從腎小球基底膜(GBM)上分離剝脫至腎小囊中，發(fā)生足細胞分離。通常認為足細胞EMT是足細胞損傷的起始環(huán)節(jié)，可以導致足細胞運動性增強、蛋白尿和腎小球纖維化。在EMT的過程中，足細胞標志物synaptopodin、緊密連

3、接蛋白-1(zonula occludens，ZO-1)、P-cadherin和nephrin降低，間質細胞標志物膠原蛋白-1、纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、成纖維細胞特異性蛋白-1(Fibroblast specific protein-1，F(xiàn)SP-1)以及α-平滑肌激動蛋白(α smooth muscle actin，α-SMA)升高。
　　盡管傳統(tǒng)觀點認為DN是繼發(fā)性腎小球疾病，現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明腎功能損傷的

4、程度與腎小管間質纖維化的程度更加相關，腎小管損傷在DN進展中作用不容忽視。在腎小管上皮細胞(Renal tubular epithelial cells，TECs) EMT的過程中，上皮細胞標志物E-cadherin和ZO-1降低，間質細胞標志物FN、collagen-i、α-SMA、FSP-1升高。Snail、Zeb和helix loop helix(HLH)家族都是引發(fā)EMT的重要轉錄因子，它們能夠抑制E-cadherin的表達并促

5、進間質細胞標志物的表達。
　　血清反應因子(serum response factor，SRF)是高度保守的順式作用因子，屬于MADS-box轉錄因子家族。與SRF結合的DNA位點為血清反應元件(Serumresponse element，SRE)，存在于幾乎所有物種的基因組中，控制著細胞骨架和收縮蛋白的表達。SRF促進中胚層細胞遷移，在胚胎體軸延長中發(fā)揮重要作用，表明SRF對胚胎發(fā)育至關重要。根據(jù)目的基因的不同，SRF可以通過兩

6、條途徑被激活（見圖1）:Ras-細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular regulated kinase，ERK)-三重復合物因子(ternary complex factors，TCFs); Rho-肌動蛋白-心肌蛋白相關轉錄因子(myocardin related transcription factors，MRTFs/MAL)。大量研究表明SRF在上皮腫瘤（如肝細胞癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等）的EMT和轉移過程中

7、發(fā)揮重要作用。在轉基因小鼠，過表達的SRF可以導致肌細胞肥大、間質纖維化和肌纖維損傷。相反的，SRF冠狀動脈平滑肌細胞敲除可以降低血管平滑肌細胞的遷移和增殖能力。此外，SRF促進轉化生長因子-β(transforming growth factorβ，TGF-β)介導的肺肌成纖維細胞分化，應用蛋白激酶A降低SRF的表達和活性可以抑制這一作用。近期王漢民等研究表明，SRF在大鼠單側輸尿管結扎模型中可導致腎小管上皮細胞EMT;SRF通過sn

8、ail信號轉導通路加重高糖透析液引起的腹膜間皮細胞EMT。
　　根據(jù)以上背景，我們提出如下假說:在高血糖情況下，大鼠腎臟中SRF和磷酸化SRF(pSRF)表達升高，并且從細胞質向細胞核轉位增加，通過Snail信號轉導通路導致足細胞和腎小管上皮細胞EMT，加重腎臟纖維化和蛋白尿;小分子抑制劑CCG-1423可以直接抑制SRF和pSRF的表達，減輕足細胞和腎小管上皮細胞EMT，改善糖尿病大鼠的腎臟纖維化和蛋白尿。為了驗證此假說，我們通

9、過1型糖尿病大鼠模型和體外培養(yǎng)永生化足細胞、近端小管上皮細胞，分別探討SRF在DN腎小球纖維化和腎小管問質纖維化中的作用及相關機制，從而發(fā)掘DN新的治療靶點。
　　研究方法:
　　為了明確SRF在DN腎小球纖維化中的作用及相關機制，體外實驗采用小鼠永生化足細胞，CCG-1423（1μM或2μ M）預處理1h后，進行高糖刺激72h;為了探索SRF是否促進足細胞EMT，我們采用SRF上調質粒轉染足細胞，并使用Transwell小

10、室遷移分析評估足細胞的遷移能力。體內實驗采用一次性腹腔注射STZ(60 mg/kg BW)構建糖尿病大鼠模型，STZ注射后每日腹腔注射CCG-1423(0.01或0.02 mg/kg BW)，持續(xù)8周。實驗結束前對大鼠稱重并放入代謝籠收取24h尿，然后抽血、灌流、取腎，隨后檢測和計算各項指標。采用western blot、實時熒光定量PCR(QPCR)和半定量PCR方法檢測小鼠足細胞和大鼠腎皮質SRF、pSRF、synaptopodin

11、、ZO-1、collagen-1、α-SMA和FSP-1等的表達;免疫熒光染色檢測足細胞中SRF的表達量和定位;實驗室方法檢測大鼠血糖、血肌酐、血尿素氮和24h尿蛋白定量;免疫組織化學染色（免疫組化）方法檢測大鼠腎小球中SRF、P-cadherin、FN等的表達;PAS染色和masson染色評估大鼠腎小球纖維化的程度。
　　為了明確SRF在DN腎小管間質纖維化中的作用及相關機制，體外實驗采用永生化人近端小管上皮細胞（HK-2細胞）

12、，CCG-1423(1μM or2μM)預處理1h后，進行高糖刺激72h;為了探索SRF是否促進HK-2細胞EMT，我們采用SRF上調質粒轉染HK-2細胞，并使用Transwell小室遷移分析評估HK-2細胞的遷移能力。體內實驗采用一次性腹腔注射STZ(60 mg/kg BW)構建糖尿病大鼠模型，STZ注射后每日腹腔注射CCG-1423（0.01或0.02 mg/kg BW），持續(xù)8周。實驗結束前對大鼠稱重并放入代謝籠收取24h尿，然后

13、抽血、灌流、取腎，隨后檢測和計算各項指標。采用western blot和QPCR方法檢測大鼠腎髓質和HK-2細胞SRF、pSRF、E-cadherin、ZO-1、collagen-1、α-SMA和FSP-1等的表達;免疫熒光染色檢測HK-2細胞中SRF的表達量和定位;實驗室方法檢測大鼠血糖、血肌酐、血尿素氮和24h尿蛋白定量;免疫組化方法檢測大鼠腎髓質中SRF、E-cadherin、FN等的表達;PAS染色評估大鼠腎小管間質纖維化的程度

14、。
　　研究結果:
　　1.SRF在DN足細胞EMT中的作用及相關機制
　　1.1高糖刺激導致足細胞EMT和SRF表達升高
　　與正常組和甘露醇對照組相比，高糖刺激72h后，足細胞中SRF和pSRF的蛋白表達和基因表達均明顯升高，足細胞標志物(synaptopodin、ZO-1)表達明顯下降，間質細胞標志物（collagen-1，F(xiàn)N，F(xiàn)SP-1和α-SMA）表達明顯升高。免疫熒光染色顯示，高糖不僅導致SRF表達

15、升高，而且誘導SRF向足細胞核內轉移。
　　1.2在足細胞中過表達SRF，導致EMT和腎小球濾過膜損傷
　　與轉染空白質粒(pcDNA3.1)的足細胞相比，轉染SRF上調質粒(pcDNA-SRF)的足細胞中synaptopodin表達下降，collagen-1、FN、FSP-1、α-SMA和Snail表達升高。在Transwell小室遷移分析中，pcDNA-SRF組遷移數(shù)量較pcDNA3.1組明顯增加。在白蛋白濾過實驗中，p

16、cDNA-SRF組白蛋白濾過量較pcDNA3.1組明顯升高。
　　1.3 CCG-1423對高糖誘導的足細胞EMT的作用
　　與高糖組相比，經CCG-1423預處理的足細胞SRF、pSRF和Snail的蛋白表達和基因表達均降低，synaptopodin表達升高，collagen-1、FN、FSP-1和α-SMA表達降低。免疫熒光染色顯示，CCG-1423不僅可以降低SRF的表達，而且還能抑制SRF向足細胞核內轉移，從而進一步

17、抑制SRF的作用。
　　1.4糖尿病大鼠腎皮質中SRF的變化
　　隨著糖尿病時間的延長，大鼠腎皮質中SRF的蛋白表達和基因表達均逐漸升高。免疫組化表明，隨著糖尿病病程的延長，腎小球中SRF的表達較正常組逐漸升高。
　　1.5 CCG-1423對糖尿病大鼠生化指標的影響
　　與正常組相比，DM組血糖、血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量和腎重體重比升高，血清白蛋白降低，所有糖尿病大鼠造模成功。與DM組相比，CCG-1

18、423治療后的糖尿病大鼠血清白蛋白明顯升高，但是血糖、血肌酐、血尿素氮和腎重體重比沒有變化。
　　1.6 CCG-1423對糖尿病大鼠腎小球纖維化和蛋白尿的影響
　　與DM組相比，CCG-1423治療后糖尿病大鼠24h尿蛋白定量降低約50％，腎皮質SRF、pSRF、collagen-1、FSP-1表達量明顯降低，synaptopodin表達量明顯升高。免疫組化顯示，與DM組相比，DM+CCG-1423組腎小球α-SMA和FN

19、的表達降低，P-cadherin表達升高。Masson染色和PAS染色均表明，CCG-1423可以使糖尿病大鼠的腎小球纖維化程度明顯減輕，腎小球硬化指數(shù)降低約50％。
　　2.SRF在DN腎小管上皮細胞EMT中的作用及相關機制
　　2.1高糖刺激導致HK-2細胞EMT和SRF表達升高
　　與正常組和甘露醇對照組相比，高糖刺激72h后，HK-2細胞中SRF和pSRF的蛋白表達和基因表達均明顯升高，上皮細胞標志物（E-ca

20、dherin和ZO-1）表達明顯下降，間質細胞標志物（collagen-1，F(xiàn)N，α-SMA和FSP-1）表達明顯升高。免疫熒光染色顯示，高糖不僅導致SRF表達升高，而且誘導SRF向HK-2細胞核內轉移，從而發(fā)揮調節(jié)轉錄的作用。
　　2.2在HK-2細胞中過表達SRF導致EMT
　　與正常組和pcDNA3.1組相比，轉染SRF上調質粒(pcDNA-SRF)的HK-2細胞中E-cadherin表達下降，collagen-1、F

21、N、α-SMA、FSP-1和Snail表達升高。在Transwell小室遷移分析中，pcDNA-SRF組遷移細胞數(shù)量較正常組和pcDNA3.1組明顯增加。
　　2.3 CCG-1423對高糖誘導的HK-2細胞EMT的作用
　　與高糖組相比，經CCG-1423預處理的HK-2細胞SRF、pSRF和Snail的蛋白表達和基因表達均降低，E-cadherin表達升高，collagen-1、FN、α-SMA和FSP-1表達降低。免疫

22、熒光染色顯示，CCG-1423不僅可以降低SRF的表達，而且還能抑制SRF向HK-2細胞核內轉移，從而進一步抑制SRF的作用。
　　2.4糖尿病大鼠生化指標的變化
　　與正常組相比，隨著糖尿病時間的延長，大鼠血糖、血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量和腎重體重比均逐漸升高，血清白蛋白逐漸降低，實驗組所有糖尿病大鼠造模成功。
　　2.5糖尿病大鼠腎髓質中SRF的變化
　　隨著糖尿病時間的延長，大鼠腎髓質中SRF的蛋白

23、表達和基因表達均逐漸升高。免疫組化表明，隨著糖尿病病程的延長，腎小管中SRF的表達較正常組逐漸升高。
　　2.6 CCG-1423對糖尿病大鼠腎小管間質纖維化和白蛋白尿的影響
　　與DM組相比，CCG-1423治療后糖尿病大鼠腎髓質SRF、pSRF、collagen-1、α-SMA、FSP-1和Snail表達量明顯降低，E-cadherin表達量明顯升高，24h尿白蛋白定量降低約36.4％。免疫組化顯示，與DM組相比，DM+

24、CCG-1423組腎小管FN、FSP-1和Snail表達降低，E-cadherin表達升高。PAS染色表明，CCG-1423可以使糖尿病大鼠的腎小管間質纖維化程度明顯減輕。
　　結論:
　　1.高血糖激活大鼠腎臟中SRF，使SRF和pSRF表達升高，并且從細胞質向細胞核轉移增加，通過Snail信號轉導通路導致足細胞和腎小管上皮細胞EMT，導致蛋白尿、腎小球纖維化和腎小管間質纖維化。
　　2.使用CCG-1423抑制SR