淫羊藿苷和淫羊藿多糖對卵泡發(fā)育與抗氧化作用的影響.pdf

1、哺乳動物卵巢卵泡的發(fā)育與閉鎖主要受到細胞死亡受體和生長促進因子的調(diào)控;生長促進因子既包括激素（如促性腺激素），也包括卵巢內(nèi)調(diào)節(jié)因子（如性腺類固醇激素、細胞因子及胞內(nèi)蛋白等）。動物卵巢含有大量的原始卵泡，往往僅有少數(shù)卵泡能夠發(fā)育到排卵前的階段或排卵;絕大多數(shù)卵泡會通過某種機制發(fā)生閉鎖退化。死亡受體的激活或者缺少關鍵生長促進因子，可能是導致凋亡的主要原因。一般認為，氧化應激、輻射、毒素和藥物等均可誘發(fā)細胞凋亡，卵巢顆粒細胞凋亡在卵泡閉鎖中扮

2、演著重要的角色。
　　淫羊藿(Epimedium)是小檗科淫羊藿屬多種植物干燥莖葉的統(tǒng)稱，傳統(tǒng)上具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功能。淫羊藿苷(ICA)和淫羊藿多糖(EPS)是淫羊藿(EP)的主要有效成份。淫羊藿能夠直接刺激大鼠卵泡顆粒細胞分泌雌二醇;淫羊藿苷可促進小鼠卵泡發(fā)育，使其發(fā)情周期提前，并能提高大鼠血清中SOD抗氧化酶的活性;淫羊藿多糖能夠提高小鼠的卵巢子宮系數(shù)，并具有抗氧化作用;但迄今少有淫羊藿苷或淫羊藿多糖對小鼠卵泡卵母

3、細胞體外發(fā)育和卵泡細胞抗氧化作用的報道。本試驗通過研究淫羊藿有效成分對小鼠卵母細胞發(fā)育的影響，進而分析淫羊藿苷和淫羊藿多糖對卵泡細胞凋亡的影響及其抗氧化作用，以期評價淫羊藿苷和淫羊藿多糖對卵泡發(fā)育的促進作用，為淫羊藿有效成分的應用及卵母細胞體外培養(yǎng)提供有益的參考。試驗結(jié)果如下:
　　1、淫羊藿苷和淫羊藿多糖對小鼠卵母細胞發(fā)育與成熟的影響
　　分別用不同劑量淫羊藿苷（ICA，0.1、0.3、0.5和0.7 mg）和淫羊藿多糖(

4、EPS，2、4、6和8 mg)每天1次連續(xù)灌服小鼠7和14d，設置生理鹽水灌服對照組。小鼠致死后按組采集卵巢有腔卵泡，分離卵母細胞置于M16培養(yǎng)液中作常規(guī)體外培養(yǎng)24h，檢查小鼠卵母細胞第一極體(pbI)排出情況，統(tǒng)計卵母細胞體外成熟率。再將各組成熟卵母細胞分別進行體外受精，KSOM液中培養(yǎng)6h觀察受精情況。結(jié)果顯示，連續(xù)灌服7d淫羊藿苷0.5 mg組的pbI排出率均較對照組有顯著提高（75.0％對63.3％;P＜0.05），并高于連續(xù)

5、灌服14 d所獲pbI排出率最高的淫羊藿苷0.3 mg組(68.1％;P＜0.05);淫羊藿多糖僅連續(xù)灌服7d的8 mg組pbI排出率較對照組顯著升高(80％;P＜0.05)。連續(xù)灌服7d淫羊藿苷0.3 mg組的受精率較對照組明顯提高（69.4％對41.1％;P＜0.05）;在連續(xù)灌服14 d組別中，與對照組相比淫羊藿苷和淫羊藿多糖組的受精率增加均不顯著(P＞0.05)。
　　2.淫羊藿苷和淫羊藿多糖對小鼠發(fā)育的影響
　　連

6、續(xù)7d分別用不同劑量淫羊藿苷（0.5和0.7 mg）和淫羊藿多糖（6和8 mg）灌服小鼠，生理鹽水對照。每天記錄小鼠情況，結(jié)束給藥次日致死小鼠，稱量并計算各組小鼠體重、增重和內(nèi)臟指數(shù)（心、肝、脾、肺和腎）。結(jié)果顯示，連續(xù)灌服7d淫羊藿苷和淫羊藿多糖對雌性小鼠體重、增重及內(nèi)臟指數(shù)（心、肝、脾、肺和腎）均無顯著影響(P＞0.05);但淫羊藿苷和淫羊藿多糖處理組均不同程度提前了母鼠的發(fā)情期。
　　3.淫羊藿苷和淫羊藿多糖對小鼠卵泡細胞凋

7、亡的作用
　　健康小鼠連續(xù)7d灌服不同劑量淫羊藿苷（0.5和0.7 mg）和淫羊藿多糖（6和8 mg），生理鹽水對照。分離收集各組小鼠卵泡細胞，用流式細胞儀檢測各組卵泡細胞凋亡率，結(jié)果表明淫羊藿苷（0.5和0.7 mg）組和淫羊藿多糖(6 mg)組卵泡細胞凋亡率顯著降低(P＜0.05);淫羊藿苷和口淫羊藿多糖處理組卵泡細胞早期凋亡率均有顯著下降(P＜0.05)。采集各組卵泡細胞、卵巢和子宮組織，用RT-PCR檢測凋亡基因Bax和抗

8、凋亡基因Bcl-2表達，結(jié)果表明淫羊藿苷0.7 mg組卵泡細胞Bcl-2/Bax基因相對表達量比值顯著提高(P＜0.05);但淫羊藿多糖6 mg組卵泡細胞Bcl-2/Bax基因相對表達量比值并無明顯改變（P＞0.05），8 mg組反而顯著降低(P＜0.05);淫羊藿苷和淫羊藿多糖處理對卵巢和子宮Bcl-2/Bax基因相對表達量比值的影響均不顯著（P＞0.05）。
　　4.淫羊藿苷和淫羊藿多糖對小鼠卵泡細胞ROS和O2-的影響

9、>　　連續(xù)7d灌服不同劑量淫羊藿苷（0.5和0.7 mg）和淫羊藿多糖（6和8 mg），生理鹽水對照，分離采集各組小鼠卵泡細胞，用DCFH-DA法流式細胞儀檢測活性氧(ROS)水平，用抗超氧陰離子自由基及產(chǎn)生超氧陰離子自由基測試盒檢測超氧陰離子水平（O2-）。結(jié)果顯示，淫羊藿多糖8 mg處理組卵泡細胞ROS和O2-水平顯著提高(P＜0.05)，淫羊藿多糖6 mg處理組卵泡細胞ROS水平顯著提高(P＜0.05);淫羊藿苷0.5和0.7 m

10、g處理組卵泡細胞的ROS和O2-水平無顯著變化(P＞0.05)。
　　5.淫羊藿苷和淫羊藿多糖對小鼠卵泡細胞抗氧化作用的影響
　　用不同劑量淫羊藿苷（0.5和0.7 mg）、淫羊藿多糖（6和8mg）和生理鹽水（對照組）連續(xù)灌服小鼠7d，采集各組小鼠卵泡細胞，分別用超氧化物歧化酶試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒和過氧化氫酶試劑盒檢測卵泡細胞SOD、GPX和CAT活性。結(jié)果顯示，淫羊藿苷和淫羊藿多糖處理均可不同程度地提高卵泡細胞

11、GPX和CAT抗氧化酶活性，尤其是淫羊藿多糖8 mg組較對照組差異顯著(P＜0.05);而各試驗組SOD抗氧化酶活性則與對照組差異不顯著（P＞0.05）。各組卵泡細胞、卵巢和子宮組織用RT-PCR檢測抗氧化酶基因SOD1、SOD2和GPx1基因相對表達量，表明淫羊藿苷0.7 mg組的卵泡細胞SOD1、SOD2均有顯著提高，且子宮GSH-PX1基因相對表達量顯著增加(P＜0.05)。淫羊藿多糖8 mg組的SOD2和GSH-PX1基因表達量