基于全基因組測(cè)序的多灶性甲狀腺乳頭狀癌克隆相關(guān)關(guān)系研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　近年來(lái)，包括我國(guó)在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行病數(shù)據(jù)均顯示甲狀腺癌發(fā)病率不斷攀升，為廣大患者以及醫(yī)療體系帶來(lái)了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。甲狀腺癌中最常見(jiàn)的亞型為甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)，約占80％-85％左右。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)PTC常表現(xiàn)為多灶性，即同一個(gè)甲狀腺內(nèi)可見(jiàn)多個(gè)腫瘤病灶。然而，針對(duì)這一常見(jiàn)的臨床現(xiàn)象背后不同病灶之間的克隆相關(guān)關(guān)系目前尚無(wú)令人滿意的研究方法。
　　新

2、一代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)和普及將腫瘤發(fā)生發(fā)展、耐藥機(jī)制以及預(yù)后監(jiān)控等各個(gè)方面的研究都推進(jìn)到了前所未有的一個(gè)層面。全基因組測(cè)序(whole genome sequencing，WGS)是新一代測(cè)序技術(shù)中代表性的一種應(yīng)用。隨著技術(shù)的發(fā)展，完成單個(gè)樣本全基因組測(cè)序所需的時(shí)間和成本逐年降低，使其具有用于科研甚至推廣至臨床檢測(cè)的可行性。
　　本研究旨在①對(duì)本大學(xué)附屬第一醫(yī)院甲乳外科近2年來(lái)甲狀腺乳頭狀癌患者病歷資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，總結(jié)出多灶發(fā)生率以

3、及多灶性甲狀腺乳頭狀癌(multifocalpapillary thyroid carcinom，mPTC)所伴隨的臨床特點(diǎn);②通過(guò)收集mPTC病例手術(shù)切除標(biāo)本并分別對(duì)不同病灶進(jìn)行全基因組測(cè)序，利用生物信息學(xué)分析方法分析點(diǎn)突變、插入缺失突變、拷貝數(shù)變異和結(jié)構(gòu)變異等信息，判斷不同病灶間克隆相關(guān)關(guān)系。
　　研究方法:
　　收集2013年1月至2015年5月期間就診于本大學(xué)附屬第一醫(yī)院甲乳外科PTC患者的臨床信息，對(duì)患者年齡、性別

4、、腫瘤病灶數(shù)量、主要病灶最大直徑、病灶位置、合并其他病癥以及轉(zhuǎn)移情況等臨床特征進(jìn)行綜合統(tǒng)計(jì)和分析，以篩選出男、女性患者中mPTC獨(dú)特的臨床特點(diǎn)。
　　經(jīng)患者知情同意后，收集mPTC患者術(shù)前外周血以及手術(shù)切除甲狀腺癌灶及癌旁組織，經(jīng)病理確認(rèn)病灶性質(zhì)后對(duì)各癌灶進(jìn)行基因組DNA提取，經(jīng)過(guò)建庫(kù)和質(zhì)控后利用Hiseq X Ten進(jìn)行測(cè)序。在基本掌握WGS數(shù)據(jù)生物信息分析方法的基礎(chǔ)上，從質(zhì)控、過(guò)濾、比對(duì)、體細(xì)胞突變、驅(qū)動(dòng)突變以及異質(zhì)性和克隆進(jìn)

5、化等方面完成對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的分析，從而對(duì)病灶間克隆相關(guān)關(guān)系進(jìn)行分析。此外，采用Sanger測(cè)序和免疫組化對(duì)驅(qū)動(dòng)突變BRAF V600E進(jìn)行確證。
　　研究結(jié)果:
　　第一部分研究中，共統(tǒng)計(jì)分析了2013年1月至2015年5月期間920名PTC患者的臨床信息，其中636名女性患者、284名男性患者，平均年齡為45.69±12.68歲。在所有這920名患者中，323名患者(35.1％)經(jīng)病理確診為多灶患者，即甲狀腺內(nèi)存在至少2個(gè)癌灶

6、。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，男性和女性患者mPTC患者中發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例顯著高于單灶PTC(男性中47.8％ vs.25.8％，P＜0.001;女性中31.3％ vs.22.1％，P=0.01)，女性患者中mPTC比單灶PTC的主要腫瘤直徑要大(P＜0.001)，此外，女性患者單灶PTC中伴隨非癌結(jié)節(jié)比例要顯著高于mPTC(P＜0.001)。
　　第二部分研究中，共計(jì)完成對(duì)3名mPTC患者（編號(hào)為mPTC_ P1-P3）的8個(gè)癌灶以及對(duì)

7、應(yīng)3個(gè)生殖系對(duì)照進(jìn)行了WGS（腫瘤樣本目標(biāo)測(cè)序深度為50X;對(duì)照樣本目標(biāo)測(cè)序深度為30X），共計(jì)獲得1897 Gbases的測(cè)序數(shù)據(jù)。經(jīng)過(guò)全基因組范圍克隆級(jí)別單核苷酸變異(single nucleotide variant，SNV)位點(diǎn)和頻率的比較，發(fā)現(xiàn)mPTC_P1和mPTC_P2不同病灶間克隆關(guān)系為克隆獨(dú)立型（即不同癌灶獨(dú)立成瘤），而mPTC_P3不同病灶間克隆關(guān)系為克隆同源型（即不同癌灶是腺內(nèi)轉(zhuǎn)移形成）。WGS、Sanger測(cè)序和

8、免疫組化均顯示著8個(gè)癌灶有BRAFV600E突變。對(duì)于克隆同源型的mPTC_P3，其中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶相比，不僅共有3個(gè)外顯子區(qū)域突變，而且還攜帶2個(gè)獨(dú)有的外顯子區(qū)域突變。在mPTC_P3的3個(gè)癌灶均可見(jiàn)22號(hào)染色體短臂存在拷貝數(shù)缺失變異。突變特征分析還發(fā)現(xiàn)與AID/APOBEC活性有關(guān)的13號(hào)特征和2號(hào)特征存在于mPTC_P3的2個(gè)病灶中。對(duì)克隆突變分發(fā)現(xiàn)5/8個(gè)癌灶中可見(jiàn)瘤內(nèi)異質(zhì)性?？寺⊙莼治霭l(fā)現(xiàn)mPTC_P3的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的

9、發(fā)生屬于早期事件。
　　研究結(jié)論:
　?、貾TC發(fā)生多灶的情況較為常見(jiàn)，本研究中920名PTC病例的多灶發(fā)生率為35.1％。
　?、趍PTC具有獨(dú)特的臨床表現(xiàn)特征，包括比單灶甲狀腺乳頭組癌(sPTC)具有更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率（男性中47.8％ vs.25.8％，P＜0.001;女性中31.3％ vs.22.1％，P=0.01）;女性患者中mPTC比sPTC的主要腫瘤直徑要大(P＜0.001)，此外，女性患者sPTC中