化瘀通絡中藥不同配伍對糖尿病腎病大鼠腎臟干預作用及對腎組織P-cadherin和TRPC6的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎?。―KD）是糖尿病（DM）最嚴重的并發(fā)癥之一，同時也是導致終末期腎病的第二大病因。該病的發(fā)病機制尚不明確，近年來研究發(fā)現腎小球濾過屏障中足細胞的損傷是導致蛋白尿產生的重要因素之一，其上的P-鈣粘素（P-cadherin）和瞬時受體電位陽離子通道-6（TRPC6）是近期發(fā)現的與蛋白尿產生密切相關的蛋白。本實驗旨在觀察化瘀通絡中藥不同配伍對DKD大鼠腎臟干預作用和對腎組織P-cadherin和TRPC6表達的影響，進一步探索

2、其可能的作用靶點。
　　方法：將70只雄性SD大鼠，體重約為100±10g，隨機分為正常組（C組， n=8）和造模組（n=62），采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯合低劑量鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射法（35 mg/kg）建立糖尿病大鼠模型，72h后三次尾靜脈取血測隨機血糖（RBG），均≥16.7 mmol/L者即為模型制備成功，不符合標準者予以剔除。之后將成模的55只大鼠再隨機分為模型組（M組）、化瘀通絡中藥組（Q組）、厄貝沙坦組（I組）、

3、化瘀組（H組）和通絡組（T組），每組11只，灌胃干預16周。分別于藥物干預后的第3天、4周末、8周末、12周末、16周末，收集各組大鼠24小時尿液，測定24小時尿量和24小時尿蛋白定量（24h UTP）；測量RBG、飲水量、攝食量，觀察其動態(tài)變化。在16周末，水合氯醛麻醉大鼠后開腹剝離雙側腎臟，稱量腎重（KW）,計算腎臟肥大指數（HI）；腹主動脈取血待行血液生化指標檢測；留取腎組織，待行光鏡、電鏡觀察，運用免疫組織化學法（IHC）、實時

4、定量PCR（Real-time PCR）和蛋白印跡法（Western Blot）進行mRNA和蛋白表達檢測。
　　結果：
　　1.各組大鼠的一般情況:C組大鼠精神狀態(tài)良好，活動靈活，攝食飲水尿量無異常，體重平穩(wěn)增加。M組則精神逐漸萎靡，多飲多食多尿，體重較前減少。各治療組較M組，上述癥狀不同程度緩解。
　　2.不同時間點各組大鼠24小時攝食量、飲水量、尿量動態(tài)變化:與同一時間點C組相比，各造模組24小時攝食量、飲水量和

5、尿量顯著增加；與同一時間點 M組比較，各治療組攝食量在任何時間點均無差異；飲水量和尿量在第16周出現差異，與同時間點M組比較，Q組和T組24小時飲水量和尿量均減少，I組和H組無明顯變化。
　　3.各組大鼠腎重、體重及腎臟肥大指數比較:各組大鼠腎重間無統計學差異。與 C組相比，各造模組體重顯著降低，腎臟肥大指數明顯升高，差異有統計學意義；與 M組比較，Q組體重升高，腎臟肥大指數降低，則I組、H組和T組差異無統計學意義。
　　4

6、.各組大鼠24h UTP比較:第3天，各組大鼠24h UTP組間無差異。
　　第4周末，與C組比較，各造模組大鼠24h UTP均上升，而各治療組差異無統計學意義。
　　第8周末，與C組比較，各造模組大鼠24h UTP均上升；與M組比較，Q組和I組大鼠24h UTP下降，H組和T組無差異。
　　第12周末，與C組比較，各造模組大鼠24h UTP均上升；與M組比較，各治療組大鼠24h UTP均下降。
　　第16周末，

7、與C組比較，各造模組大鼠24h UTP均上升；與M組比較，各治療組大鼠24h UTP均下降；與I組比較，Q組下降；與Q組比較，H組和T組稍高。
　　5.各組大鼠隨機血糖、血脂比較:不同時間點C組大鼠RBG基本穩(wěn)定；各造模組RBG均顯著升高，且各造模組組間無差異。與 C組比較，各造模組大鼠膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇均升高。與 M組比較，各治療組大鼠甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、極低

8、密度脂蛋白膽固醇均降低；高密度脂蛋白膽固醇方面，Q組和T組大鼠升高，I組和H組差異無統計學意義。
　　6.各組大鼠血清蛋白和腎功能比較:各組間總蛋白（TP）和白蛋白（ALB）差異無統計學意義。與C組比較，M組大鼠血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）和尿酸（UA）均升高；與M組比較，Q組、I組和T組大鼠BUN均降低， H組大鼠無差異，各治療組大鼠 Scr和 UA均降低。
　　7.腎臟形態(tài)學觀察結果
　　7.1光鏡觀察結果

9、:光鏡下觀察C組腎小球結構清晰。M組腎小球肥大，囊腔變窄，呈裂隙狀，系膜基質增生堆積伴基底膜彌漫性增厚，腎小管排列紊亂。與M組比較，各治療組不同程度改善。
　　7.2透射電鏡觀察結果:透射電鏡下觀察C組腎小球結構相對正常。M組結構紊亂，基底膜彌漫性增厚，足突出現變寬、扁平、甚至融合消失。與M組比較，各治療組病理改變稍減輕。
　　8.免疫組化檢測腎皮質P-cadherin、TRPC6的表達:光鏡下可觀察到C組P-cadheri

10、n沿腎小球基底膜成線性分布，蛋白表達量較多；與C組比較，M組表達量明顯較少；與M組比較，Q組、I組表達明顯增加，H組和T組無明顯差異。C組TRPC6表達微弱；與C組比較，M組TRPC6表達較強；與M組比較，各治療組不同程度改善；各治療組組間無明顯差異。
　　9.Real-time PCR檢測各組大鼠腎皮質P-cadherin和TRPC6 mRNA的表達:與C組比較，M組P-cadherin mRNA水平顯著下調；與M組比較，Q組和

11、I組P-cadherin mRNA水平明顯上調，H組和T組則無明顯上調；與Q組和I組比較，H組和T組相對降低。與C組比較，M組大鼠TRPC6 mRNA表達水平升高；與M組比較，各治療組大鼠TRPC6 mRNA表達相對降低；且各治療組組間無統計學差異。
　　10.Western Blot檢測各組大鼠腎皮質P-cadherin和TRPC6蛋白表達:與C組比較，M組P-cadherin蛋白表達量顯著下調；與M組比較，Q組和I組表達顯著上

12、調，且該兩組間差異無統計學意義，H組和T組無明顯上調；與Q組和I組比較，H組和T組相對降低。與C組比較，M組TRPC6蛋白表達量顯著升高；與M組比較，各治療組 TRPC6表達顯著降低；且各治療組組間差異無統計學意義。
　　結論：
　　1.高糖高脂飼料聯合低劑量鏈脲佐菌素腹腔注射法制備的DKD大鼠模型基本成功，先后出現多飲、多食、多尿，逐漸出現蛋白尿，且符合相應的病理表現。
　　2.化瘀通絡中藥能夠改善DKD大鼠一般情況