低氧抑制MCF-7細胞中信號素3A表達并調(diào)控成骨前體細胞分化的研究.pdf

1、目的：
　　乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在晚期易轉(zhuǎn)移至腦、肝臟、骨骼等器官和系統(tǒng)，患者一旦發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，即宣告了疾病的不可治愈。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移最常見于脊柱，且多為溶骨性骨破壞，造成骨量丟失和病理性骨折，引起患者疼痛、高鈣血癥、癱瘓等一系列并發(fā)癥，嚴重影響患者的預后和生存質(zhì)量。因此，臨床上急需行之有效的方法來治療和預防溶骨性骨破壞，與此同時，明確乳腺癌溶骨性破壞的作用機制有利于為臨床上新型藥物和治療手段的開發(fā)提供基礎支持。

2、　　信號素3A(semaphorin3A，Sema3A)是神經(jīng)發(fā)育過程中的導向因子之一，隨著對其認識的逐漸加深，其在骨代謝領域的研究也有了突破性的進展。Sema3A作為一種“骨保護因子”能夠促進成骨前體細胞分化成熟，增加骨密度;同時抑制破骨細胞分化，減少骨吸收作用。雖然Sema3A在生理狀態(tài)下骨代謝中的作用較為明確，但對其病理狀態(tài)下的研究甚少。
　　由于腫瘤轉(zhuǎn)移灶代謝相對活躍，而血管生成速度相對滯后，其微環(huán)境均存在一定程度的缺氧。

3、以往的研究表明，低氧作為腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的一種危險因素，能夠加速腫瘤的變異、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。體外低氧環(huán)境作為上游因素，能通過多種因子調(diào)控腫瘤細胞的生物學功能。本研究猜想，Sema3A可能作為低氧誘導下的信號分子之一，參與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移骨破壞的調(diào)節(jié)，通過體外低氧刺激乳腺癌MCF-7細胞，研究常氧與低氧條件下收集MCF-7的細胞條件培養(yǎng)液對小鼠成骨前體細胞MC3T3-E1分化能力的影響，并探討Sema3A的表達對低氧調(diào)控乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中成

4、骨前體細胞分化的作用與機制。
　　方法：
　　一、低氧MCF-7條件培養(yǎng)液對成骨前體細胞分化的影響。
　　1.收集乳腺癌MCF-7細胞在常氧和低氧條件下培養(yǎng)48h后的條件培養(yǎng)液;
　　2.采用堿性磷酸酯酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測試劑盒和BCIP/NBT ALP顯色試劑盒檢測MC3T3-E1細胞中ALP的活性;
　　3.采用茜素紅S(alizarin red S，ARS)染

5、色檢測MC3T3-E1細胞礦化情況。
　　二、低氧對MCF-7細胞中Sem a3A表達的影響。
　　1.采用實時熒光定量PCR法檢測在常氧和低氧條件下培養(yǎng)0、12、24和48h后乳腺癌MCF-7細胞中Sema3A的mRNA表達變化;
　　2.采用蛋白印跡法檢測在常氧和低氧條件下培養(yǎng)0、12、24和48h后乳腺癌MCF-7細胞中Sema3A的蛋白表達變化。
　　三、低氧誘導因子對MCF-7細胞Sema3A表達的調(diào)控

6、。
　　1.利用shRNA慢病毒構建HIF-1α和HIF-2α低表達的MCF-7細胞系，并確定干擾效率;
　　2.采用實時熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染病毒后MCF-7細胞中Sema3A的mRNA表達隨時間的變化;
　　3.采用蛋白印跡法檢測轉(zhuǎn)染病毒后MCF-7細胞中Sema3A的蛋白表達隨時間的變化。
　　四、外源性Sema3A對成骨前體細胞分化的影響。
　　1.將重組人Sema3A(recombinant h

7、uman semaphorin3A，rhS ema3A)加入到低氧條件培養(yǎng)液誘導的MC3T3-E1細胞中;
　　2.采用BCIP/NBT ALP顯色試劑盒檢測MC3T3-E1細胞中ALP的活性;
　　3.采用茜素紅S（alizarin red S，ARS）染色檢測MC3T3-E1細胞礦化情況。
　　4.實時熒光定量PCR法檢測MC3T3-E1細胞中ALP、Runt相關轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcr

8、iption factor2，RUNX2)、骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)和轉(zhuǎn)錄因子Osterix(Osx)的mRNA表達水平。
　　結果：
　　一、低氧MCF-7條件培養(yǎng)液對成骨前體細胞分化的影響。
　　1.相比于常氧條件下獲得的MCF-7條件培養(yǎng)液(NorCM)組，低氧條件培養(yǎng)的MCF-7條件培養(yǎng)液(HyCM)組可以使MC3T3-E1細胞的ALP活性明顯減弱(P＜0.05);
　　2.ARS染色顯

9、示，HyCM組比NorCM組鈣化面積明顯減小(P＜0.05)。
　　二、低氧對MCF-7細胞中Sema3A表達的影響。
　　低氧條件下處理MCF-7細胞24h和48h后，細胞中Sema3A的mRNA和蛋白的表達水平明顯低于常氧條件下相同時間點的Sema3A表達水平（P值均＜0.05）。
　　三、低氧誘導因子對乳腺癌細胞Sema3A表達的調(diào)控。
　　1.HIF-1α和HIF-2αshRNA可分別有效干擾乳腺癌MCF

10、-7細胞HIF-1α和HIF-2α的表達（P值均＜0.05）;
　　2.干擾HIF-1α表達后，MCF-7細胞Sema3A的mRNA和蛋白表達在低氧誘導下與常氧誘導相比無明顯變化;
　　3.干擾HIF-2α表達后，在低氧誘導下12、24和48h的MCF-7細胞中Sema3A的mRNA和蛋白的表達水平明顯低于常氧條件下相同時間點的Sema3A表達水平(P值均＜0.05)。
　　四、外源性Sema3A對成骨前體細胞分化的影

11、響。
　　1.相比于HyCM組，HyCM+S ema3A組MC3T3-E1細胞的ALP活性及ARS染色明顯增強（P值均＜0.05）;
　　2.加入rhSema3A的HyCM組，其分化早期（RUNX2、ALP）和分化晚期(OCN、Osx)的mRNA表達較HyCM組之前的表達明顯升高（P值均＜0.05）。
　　結論：
　　1.低氧MCF-7條件培養(yǎng)液比常氧MCF-7條件培養(yǎng)液誘導成骨前體細胞分化能力顯著降低;