左旋聚乳酸納米纖維對(duì)PC12細(xì)胞分化影響的代謝組學(xué)研究和系統(tǒng)生物學(xué)分析.pdf

1、納米纖維能夠有效模仿細(xì)胞外基質(zhì)，提供適合的接觸引導(dǎo)來(lái)幫助神經(jīng)細(xì)胞分化和神經(jīng)突觸生長(zhǎng)，因此成為神經(jīng)組織工程常用的生物材料。為在神經(jīng)組織工程中進(jìn)一步應(yīng)用定向納米纖維，設(shè)計(jì)新的納米纖維材料表面，全面深入地闡釋定向納米纖維影響神經(jīng)細(xì)胞分化的分子機(jī)理，需要了解這個(gè)過(guò)程中所有基因、mRNA、蛋白質(zhì)、代謝物的差異表達(dá)以及組分相互間的關(guān)系。近年出現(xiàn)的高通量技術(shù)和系統(tǒng)生物學(xué)方法為從RNA、蛋白質(zhì)、代謝物等層次，全而系統(tǒng)地了解生物材料對(duì)細(xì)胞的影響和深入研究

2、分子機(jī)理提供了強(qiáng)有力的技術(shù)方法支持。
　　本論文的目的是綜合運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)方法，研究左旋聚乳酸定向/不定向納米纖維對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)代謝物表達(dá)的影響，在代謝層次揭示旋聚乳酸定向/不定向納米纖維對(duì)PC12細(xì)胞的影響。隨后與本課題組前期的研究結(jié)果（轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)）進(jìn)行聯(lián)合分析，從系統(tǒng)生物學(xué)的角度闡釋PLLA定向納米纖維影響PC12細(xì)胞分化的機(jī)理。
　　本論文的具體工作如下:
　　1、采用靜電紡絲法制備左旋

3、聚乳酸(PLLA)定向/不定向納米纖維，采用勻膠法制備PLLA薄膜。對(duì)三種材料進(jìn)行了掃描電子顯微鏡(SEM)觀察。結(jié)果表明，PLLA薄膜表面比較平滑，PLLA定向/不定向納米纖維粗細(xì)均一且無(wú)串珠，纖維直徑分別為279.58±6.67 nm和245.02±7.93nm，定向納米纖維具有較好的取向性;
　　2、將預(yù)分化48h的PC12細(xì)胞分別種植在PLLA定向納米纖維（實(shí)驗(yàn)組1，簡(jiǎn)稱AF組）、PLLA不定向納米纖維（實(shí)驗(yàn)組2，簡(jiǎn)稱RF

4、組）和PLLA薄膜（對(duì)照組，簡(jiǎn)稱C組）上12h、24h和36h，搜集細(xì)胞樣本用于代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)，一共六個(gè)實(shí)驗(yàn)組(AF組的三個(gè)間分別簡(jiǎn)稱為A12、A24和A36，RF組的分別簡(jiǎn)稱為R12、R24和R36)，三個(gè)對(duì)照組（分別簡(jiǎn)稱為C12、C24和C36），每組106～107個(gè)細(xì)胞樣本(n=5);
　　3、采用基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組學(xué)研究手段，分別分析了PC12細(xì)胞種植在左旋聚乳酸的三種表面（定向納米纖維表面、不定向納米纖維表面和薄

5、膜表面）12h、24h和36h后，細(xì)胞內(nèi)代謝物的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定性分析，得到六個(gè)實(shí)驗(yàn)組和三個(gè)對(duì)照組的代謝物表達(dá)譜峰圖。使用主成分分析法和最小二乘判別分析法結(jié)合t檢驗(yàn)，篩選得到相對(duì)于對(duì)照組差異表達(dá)的代謝物，相對(duì)于C12組，A12組和R12組差異表達(dá)的代謝物數(shù)目分別為53種和54種，相對(duì)于C24組，A24組和R24組差異表達(dá)的代謝物數(shù)目分別為50種和47種，相對(duì)于C36組，A36組和R36組差異表達(dá)的代謝物數(shù)目分別為32種和42種;
　

6、　4、采用生物信息學(xué)方法對(duì)差異表達(dá)代謝物進(jìn)行了聚類分析和MetPA分析，發(fā)現(xiàn)在PLLA定向和不定向納米纖維這兩種表面上培養(yǎng)了12h的細(xì)胞內(nèi)代謝物表達(dá)情況與培養(yǎng)了24h和36h的細(xì)胞內(nèi)代謝物表達(dá)情況差別較大，對(duì)AF組和RF組三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均差異表達(dá)的代謝物進(jìn)行通路分析，得到的通路中，AF組與RF組共有的通路苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，苯丙氨酸代謝，組氨酸代謝以及AF組有而RF組沒(méi)有的花生四烯酸代謝和牛磺酸，亞牛磺酸代謝通路與神經(jīng)細(xì)胞的分

7、化相關(guān);
　　5、對(duì)所得的代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和課題組前期得到的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，得到種植在PLLA定向納米纖維表面的PC12細(xì)胞內(nèi)基因、蛋白質(zhì)和代謝物的差異表達(dá)引起的通路有11條，而PLLA不定向納米纖維表面的PC12細(xì)胞內(nèi)基因、蛋白質(zhì)和代謝物的差異表達(dá)引起的通路有7條。在這些通路中，AF組與RF組共有的通路酪氨酸通路和AF組有而RF組沒(méi)有的鞘脂類代謝和甘油磷脂代謝通路與分化相關(guān)，從氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝兩個(gè)部

8、分對(duì)PLLA影響PC12細(xì)胞的分化機(jī)理進(jìn)行討論發(fā)現(xiàn)，基因Lao1的下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致了苯丙氨酸的下調(diào)表達(dá)，加之與酪氨酸分解相關(guān)的蛋白質(zhì)Gstz1上調(diào)表達(dá)，導(dǎo)致酪氨酸下調(diào)表達(dá)?；駻oc3上調(diào)表達(dá)與基因Aldh3a1下調(diào)表達(dá)的共同作用下，多巴胺上調(diào)表達(dá)?；駻ldh3a1的下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致去甲變腎上腺素的上調(diào)表達(dá)?；騊la2g4b上調(diào)表達(dá)導(dǎo)致磷脂酶的上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)了溶血磷脂和花生四烯酸的釋放，因此能夠分泌更多神經(jīng)遞質(zhì)。因此PLLA定向納米纖維表面