補體介導(dǎo)的免疫病理損傷在重癥肝炎發(fā)病中的作用及機制研究.pdf

1、重癥肝炎的病死率非常高，病情發(fā)展迅速、兇險，臨床預(yù)后差，盡管對其致病機制等展開了大量的研究工作，但目前對其致病機理仍不十分清楚。鑒于臨床重癥肝炎致病因素多樣，肝損傷機理復(fù)雜，不同誘因所引起的重癥肝炎在病理損傷、致病機理既有相似之處，也有不同的方面。因此，建立由不同因素引起的動物模型對深入開展重癥肝炎急性肝損傷的機制研究具有重要意義。補體是機體免疫防御的第一道防線，但補體的過度激活又是造成免疫病理性損傷的介質(zhì)。補體在重癥肝炎免疫病理損傷及

2、發(fā)病機制中的生物學(xué)作用還少見報道。
　　 本研究建立LPS/D-GalN誘導(dǎo)小鼠重癥肝炎急性肝損傷和MHV-3病毒感染小鼠重癥肝炎急性肝損傷動物模型，研究這兩種模型，并利用C3缺陷鼠(C3-/-)、靶向補體抑制劑(CR2-FH)阻斷補體旁路激活途徑以及阻斷補體片段C3a與其受體C3aR的結(jié)合等方面探索補體介導(dǎo)的免疫病理損傷在重癥肝炎急性肝損傷中的作用，為探索臨床干預(yù)治療提供實驗和理論依據(jù)。
　　 一、補體在LPS/D-G

3、alN誘導(dǎo)小鼠重癥肝炎急性肝損傷中的作用研究
　　 1、LPS/D-GalN誘導(dǎo)小鼠重癥肝炎急性肝損傷模型建立：以不同劑量LPS/D-GalN腹腔注射C57BL/6小鼠，觀察存活時間及肝臟損傷大病理，確定實驗LPS/D-GalN使用劑量。并在不同時間點觀察模型肝組織病理損傷，檢測血清中ALT表達(dá)水平以及炎癥因子水平。結(jié)果顯示該模型呈現(xiàn)重癥肝炎急性肝損傷進(jìn)程性病變。該模型穩(wěn)定、易行，可為急性肝損傷的實驗研究提供理想的免疫病理損傷模

4、型。
　　 2、補體在重癥肝炎急性肝損傷免疫病理研究：采用免疫組化技術(shù)檢測不同時間點各組小鼠肝組織中C3的沉積與分布，Real Time PCR技術(shù)檢測不同時間點肝組織補體受體C3aR、C5aR表達(dá)水平變化。結(jié)果顯示，與正常C57BL/6小鼠組相比，染毒小鼠的補體C3在肝臟組織的沉積呈動態(tài)變化，1h時沉積增加，主要沉積在肝中央靜脈周圍，但4h時表達(dá)減少，8h時再次達(dá)高峰，主要沉積在組織壞死區(qū)域。同時，C3aR表達(dá)水平1h時升高，

5、4h下降，8h時再達(dá)高峰。C5aR表達(dá)水平持續(xù)升高，8h時達(dá)高峰。實驗結(jié)果表明小鼠染毒后肝組織損傷的程度與補體成分在肝內(nèi)表達(dá)情況密切相關(guān)，補體的過度激活導(dǎo)致肝組織補體C3沉積的增加，并誘導(dǎo)C3aR、C5aR在肝細(xì)胞的異常表達(dá)。
　　 3、阻斷補體激活途徑在LPS/D-GalN誘導(dǎo)小鼠重癥肝炎急性肝損傷模型中的作用研究
　　 (1)阻斷補體C3激活途徑減輕小鼠重癥肝炎急性肝損傷：采用LPS(50ng)/D-GalN(6mg

6、)腹腔注射C3-/-小鼠及C57BL/6小鼠，比較兩組小鼠急性肝損傷的差異：觀察肝組織病理HE染色及檢測不同時間點(0h、1h、4h、8h)血清中炎癥因子和ALT表達(dá)水平變化，比較兩組小鼠存活率。結(jié)果顯示，同一時間點的炎癥因子IL-6、MCP-1及TNF-α表達(dá)水平C57BL/6小鼠要高于C3-/-小鼠，且C3-/-小鼠的病情嚴(yán)重程度要明顯輕于C57BL/6小鼠，病程發(fā)展也要較C57BL/6小鼠緩慢。同時，阻斷補體C3激活途徑能延長小鼠

7、生存率。實驗進(jìn)一步證明補體在LPS/D-GalN誘導(dǎo)小鼠重癥肝炎急性肝損傷中發(fā)揮著重要作用。
　　 (2)阻斷C3a與其受體C3aR結(jié)合減輕小鼠重癥肝炎急性肝損傷：腹腔注射LPS/D-GalN前45min和后45min，尾靜脈注射C3aR阻斷劑40μ g/只。觀察各時間小鼠肝組織病理、血清ALT及血清炎癥因子表達(dá)水平；并比較C3aR阻斷小鼠與C57BL/6小鼠存活率。該實驗結(jié)果顯示C3aR阻斷小鼠的存活時間明顯長于C57BL/6

8、小鼠。肝組織病理學(xué)顯示C3aR阻斷小鼠的肝損傷進(jìn)程明顯比C57BL/6小鼠緩慢，其病理損傷程度也比C57BL/6小鼠輕。C57BL/6小鼠的IL-6、TNF-α明顯高于C3aR阻斷小鼠。各時間點補體C3在C3aR阻斷小鼠肝組織沉積較C57BL/6小鼠減少。因此，阻斷C3a和其受體C3aR的結(jié)合，可降低急性肝損傷時炎癥因子的升高，從而減低或推遲炎癥因子介導(dǎo)機體的損傷。阻斷C3aR有利于減輕急性肝損傷模型的病理損傷及炎癥反應(yīng)。
　　

9、 (3)利用靶向補體抑制物CR2-FH阻斷補體旁路激活途徑減輕C57BL/6小鼠肝組織病理損傷：腹腔注射LPS/D-Ga1N，即刻尾靜脈注射CR2-FH，觀察不同時間點肝組織病理損傷及補體C3在肝組織的沉積。結(jié)果顯示，注射CR2-FH的小鼠其肝損傷進(jìn)程明顯緩慢于C57BL/6小鼠，其病理損傷程度也要比LC57BL/6小鼠輕。
　　 二、補體在MHV-3病毒感染小鼠重癥肝炎急性肝損傷模型中的作用和機制研究
　　 1、MHV

10、-3病毒感染C57BL/6小鼠重癥肝炎急性肝損傷模型建立：MHV-3腹腔注射C57BL/6小鼠，測定LD50及確定實驗致死劑量。觀察模型肝組織病理損傷及檢測不同時間點血清中ALT表達(dá)水平變化以及血清炎癥因子水平。同時檢測不同時間點病毒滴度和病毒載量。結(jié)果顯示，本實驗建立的MHV-3感染小鼠導(dǎo)致病毒性重癥肝炎急性肝損傷模型從肝組織病理學(xué)、血清ALT水平及炎癥因子、病毒復(fù)制等方面來看，其病變有一定的發(fā)展，符合病毒性急性重癥肝炎肝損傷發(fā)生發(fā)展

11、的表現(xiàn)。能模擬肝炎病毒在肝組織內(nèi)的復(fù)制過程和引起的損傷情況。
　　 2、補體激活介導(dǎo)MHV-3病毒感染C57BL/6小鼠重癥肝炎急性肝損傷：利用免疫組織化學(xué)、Real Time PCR等方法檢測不同時間點小鼠肝組織中C3的沉積與分布及補體受體C3aR、C5aR表達(dá)水平變化。結(jié)果表明，與正常C57BL/6小鼠相比，補體C3水平在染毒后6h升高，12h達(dá)到高峰，但24h開始小鼠肝組織C3沉積減少，但72h時再次增加，且主要沉積在肝壞

12、死區(qū)域。同時，C3aR、C5aR表達(dá)水平均呈先上升，再下降，再在72h升高的趨勢，C3aR的第一個表達(dá)高峰在12h，而C5aR在6h。其結(jié)果都表明補體的激活與MHV-3感染小鼠致重癥肝炎急性肝損傷密切有關(guān)。
　　 3、阻斷補體激活途徑在MHV-3感染小鼠重癥肝炎急性肝損傷模型中的作用研究：
　　 (1)阻斷補體C3激活途徑加重小鼠重癥肝炎急性肝損傷：采用致死劑量的MHV-3病毒分別感染C3-/-小鼠及C57BL/6小鼠，

13、比較兩組小鼠急性肝損傷的差異。結(jié)果顯示，在MHV-3感染小鼠重癥肝炎急性肝損傷模型中，從組織病理學(xué)、血清生化、炎癥因子及病毒復(fù)制等方面來看，雖然兩組生存率之間沒有差異(P>0.05)，但C3-/-小鼠的病程發(fā)展要快于C57BL/6小鼠，且同一時間點的病情也比C57BL/6小鼠嚴(yán)重。實驗結(jié)果顯示，在病毒性的急性肝損傷模型中，補體系統(tǒng)的激活可能對病毒發(fā)揮調(diào)理作用，抑制病毒復(fù)制和擴散，對機體主要起積極保護(hù)作用。
　　 (2)阻斷C3a

14、與其受體C3aR結(jié)合加重小鼠重癥肝炎急性肝損傷：建立C3aR阻斷小鼠感染MHV-3致重癥肝炎急性肝損傷模型，雌性C57BL/6小鼠48只，先尾靜脈注射C3aR阻斷劑40μ g/只，1h后注射MH V-3病毒，間隔12h、36h后再分別注射C3aR阻斷劑一次，劑量仍為40μ g/只。研究結(jié)果表明，C57BL/6小鼠肝組織病變進(jìn)程明顯緩慢于C3aR阻斷小鼠，補體C3在C57BL/6小鼠肝臟組織的沉積明顯強于C3aR阻斷小鼠。綜上所述，從組織

15、病理學(xué)、血清生化、炎癥因子及病毒復(fù)制等方面來看，C3aR阻斷小鼠的病程發(fā)展介于C3-/-小鼠與C57BL_/6小鼠之間，且同一時間點的病情嚴(yán)重程度也介于兩者之間。比C57BL/6小鼠嚴(yán)重，卻比C3-/-小鼠稍輕。進(jìn)一步提示C3a作為調(diào)理素在機體抗病毒方面也發(fā)揮重要作用。
　　 通過上述兩部分比較系統(tǒng)的實驗，本研究發(fā)現(xiàn)，在LPS/D-GalN誘導(dǎo)小鼠重癥肝炎急性肝損傷中，補體主要由旁路途徑激活，其激活過程中產(chǎn)生的過敏毒素，能促進(jìn)炎

16、癥的發(fā)生，同時補體能介導(dǎo)自身靶細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致靶細(xì)胞的壞死；用靶向補體抑制劑CR2-FH能一定程度上阻斷補體旁路途徑的激活，減輕補體介導(dǎo)的免疫病理損傷。補體介導(dǎo)的免疫病理損傷在LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠重癥肝炎急性肝損傷中發(fā)揮重要的致病作用。在MHV-3病毒感染急性肝損傷中，補體激活產(chǎn)生的調(diào)理素可促進(jìn)吞噬細(xì)胞對病毒的吞噬作用，阻止病毒進(jìn)入靶細(xì)胞，抑制病毒復(fù)制，減輕肝組織損傷；在由該類病毒性病原引起的重癥肝炎肝組織損傷發(fā)病中，補體不是