氧化苦參堿抑制博來(lái)霉素致小鼠肺纖維化形成及相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肺纖維化(Pulmonary fibrosis，PF)是由于多種原因?qū)е碌姆闻K損傷，是一種進(jìn)行性、破壞性疾病。病因包括毒物、自身免疫、藥物、感染以及創(chuàng)傷等。PF的病理特點(diǎn)表現(xiàn)為片狀慢性間質(zhì)性炎癥、過(guò)多的細(xì)胞外基質(zhì)沉積、成纖維細(xì)胞增殖以及肺泡結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致進(jìn)行性纖維化及肺功能喪失[1-3]。迄今為止，盡管已有多方面的實(shí)驗(yàn)及臨床研究，但PF的發(fā)病率和死亡率依然呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，而且平均存活期從確診至死亡不超過(guò)3年[4，5]。PF的傳統(tǒng)的治療策略包

2、括糖皮質(zhì)激素或聯(lián)合免疫抑制劑，然而這些藥物的療效正受到質(zhì)疑，而且長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素通常會(huì)產(chǎn)生一些副作用，如免疫妥協(xié)、胃潰瘍、高血壓、骨質(zhì)疏松、內(nèi)分泌和代謝異常[1，6]。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)有效的、可以信賴(lài)的藥物治療PF。
　　 氧化苦參堿(Oxymatrine，OM)，是從傳統(tǒng)中藥苦參中分離出來(lái)的生物堿?？鄥⒁呀?jīng)被中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于乙肝治療[7，8]。累積證據(jù)表明，OM具有多種生物和藥理學(xué)特性，例如抗炎[9-11]、

3、抗腫瘤[12，13]、抗凋亡[14]、抗纖維化[15]、抗氧化[16]及抗心律失常作用[17]。陳等[18]研究證實(shí)OM能夠減輕博來(lái)霉素(bleomycin，BLM)誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，這種作用與抑制BLM誘導(dǎo)的肺炎癥、脂質(zhì)過(guò)氧化、成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成相關(guān)。然而，OM對(duì)PF的抗纖維化作用的確切機(jī)制仍未被完全闡明。
　　 一氧化氮(Nitric oxide，NO)是一種內(nèi)源性短時(shí)存在的自由基，在許多肺疾病中發(fā)揮重要作用，包括P

4、F[19,20]。目前有三種一氧化氮合成酶(NO synthase，NOS)，即神經(jīng)型(nNOS)、內(nèi)皮型(eNOS)、誘導(dǎo)型(iNOS)[21]。以前的動(dòng)物模型和人類(lèi)的PF研究中證實(shí)存在iNOS誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生增加[22-24]。在PF中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transforming growthfactor-β1，TGF-β1)是公認(rèn)的關(guān)鍵性致纖維生成細(xì)胞因子，可以導(dǎo)致膠原在肺部的過(guò)度生成和沉積[25]。在PF患者和動(dòng)物模型的肺組織中已

5、經(jīng)發(fā)現(xiàn)TGF-β1的過(guò)高表達(dá)[26]。
　　 根據(jù)上述的研究基礎(chǔ)，我們假想在BLM誘導(dǎo)PF中，OM可通過(guò)抑制iNOS表達(dá)和TGF-β/smad信號(hào)途徑發(fā)揮抗纖維化作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過(guò)建立博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型，觀察OM對(duì)小鼠肺纖維化抑制作用，并且進(jìn)一步探討其抗纖維化作用潛在的機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 50只C57BL/6鼠被隨機(jī)分為5組:(1)對(duì)照組:氣管滴注生理鹽水;(2)模型

6、組:氣管滴注博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化組(3.0mg/kg);(3)-(5)氧化苦參堿低、中、高劑量組:在滴注博來(lái)霉素一天后每天分別通過(guò)腹腔注射10，20，40mg/kg的氧化苦參堿進(jìn)行治療，連續(xù)注射21天。在博來(lái)霉素滴注后的第15天和22天分別收集支氣管肺泡灌洗液和肺組織。HE染色法觀測(cè)肺組織形態(tài)學(xué)改變。利用試劑盒檢測(cè)肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和NO的水平，以及肺組織勻漿中MPO的活性和MDA含量。通過(guò)免疫組化、RT-PCR、west

7、em blot檢測(cè)肺組織中iNOS的表達(dá)。此外，通過(guò)western blot檢測(cè)肺組織中TGF-β1，Smad3，p-Smad3，Smad2,p-Smad2表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 一、在博來(lái)霉素誘導(dǎo)鼠肺纖維化模型中，氧化苦參堿可以減輕肺組織病理改變
　　 經(jīng)氧化苦參堿治療21天之后通過(guò)HE染色來(lái)評(píng)價(jià)肺部組織病理學(xué)改變。在普通光學(xué)顯微鏡下，陰性對(duì)照組的肺組織形態(tài)學(xué)顯示為正常的肺泡腔和正常肺泡間隔。僅用博來(lái)霉

8、素處理的小鼠肺組織顯示明顯組織病理學(xué)異常，表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)混亂、廣泛的間隔增厚以及伴隨淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的密集間質(zhì)浸潤(rùn)。與之形成對(duì)照，低中高劑量氧化苦參堿組分別顯示出炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及間質(zhì)增厚有適度的改善。
　　 二、在博來(lái)霉素誘導(dǎo)鼠肺纖維化模型中，氧化苦參堿可以降低肺組織中MPO活性
　　 MPO活性是中性粒細(xì)胞流入組織的一個(gè)標(biāo)志，利用試劑盒對(duì)之進(jìn)行檢測(cè)。與陰性對(duì)照組相比，BLM滴注導(dǎo)致了MPO活性的急劇升高

9、，從2.81±0.24升到8.23±0.35 U/g蛋白(P＜0.01，n=5)。然而，OM(10，20，40 mg/kg)治療后，顯著減低了MPO活性，分別從8.23±0.35到6.37±0.55(P＜0.01，n=5)，從8.23±0.35到6.07±0.47(P＜0.01, n=5)，從8.23±0.35到4.49±0.42(P＜0.01, n=5)。OM呈劑量依賴(lài)性抑制MPO活性。
　　 三、在博來(lái)霉素誘導(dǎo)鼠肺纖維化模型

10、中，氧化苦參堿可以降低肺泡灌洗液中TNF-α和I L-6濃度
　　 BALF中TNF-a和IL-6代表促炎癥反應(yīng)介質(zhì)，它們被認(rèn)為在PF發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。利用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)TNF-α和IL-6在陰性組最低限度表達(dá)。在BLM滴注2周之后，在BALF中觀察到TNF-α和IL-6水平明顯增加。然而，這些水平在OM應(yīng)用后呈劑量依賴(lài)性下降，(P＜0.01，n=5)。
　　 四、在博來(lái)霉素誘導(dǎo)鼠肺纖維化模型中，

11、氧化苦參堿可以抑制TGF-β/smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
　　 為了研究在BLM誘導(dǎo)的PF中，OM是否通過(guò)抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路發(fā)揮抗纖維化作用，我們首先應(yīng)用westemblot檢測(cè)了肺組織中TGF-β1的蛋白表達(dá)，BLM的滴注可以明顯增加肺組織中TGF-β1的蛋白表達(dá)，經(jīng)過(guò)OM治療可以呈劑量依賴(lài)性下調(diào)TGF-β1的蛋白表達(dá)。通過(guò)TGF-β1受體Ⅰ活化引起Smad信號(hào)磷酸化是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的始發(fā)的關(guān)鍵步驟，我們應(yīng)用weste

12、mblot檢測(cè)了BLM處理鼠肺中p-Smad2、p-Smad3。BLM組與陰性對(duì)照比，Smad2、Smad3磷酸化增加，OM治療以劑量依賴(lài)性方式抑制BLM活化的信號(hào)分子。
　　 五、在博來(lái)霉素誘導(dǎo)鼠肺纖維化模型中，氧化苦參堿可以降低肺組織中MDA水平
　　 MDA做為脂質(zhì)過(guò)氧化一個(gè)指標(biāo)，在BLM滴注的第22天，利用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。陰性組為2.66±0.35 nmol/mg蛋白，BLM組為19.2±1.39 nmol/mg

13、蛋白，顯著升高(P＜0.01，n=5)。在OM(10，20，40 mg/kg)處理后，BLM誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化作用明顯下降，分別為12.78±0.79(P＜0.01，n=5)，9.06±0.79(P＜0.01，n=5)，4.71±0.45 nmol/mg蛋白(P＜0.01，n=5)，分別與BLM組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。OM降低MDA水平呈劑量依賴(lài)性。
　　 六、在博來(lái)霉素誘導(dǎo)鼠肺纖維化模型中，氧化苦參堿通過(guò)抑制iNOS表達(dá)減少NO合成

14、發(fā)揮抗纖維化作用
　　 （一）氧化苦參堿可以降低肺泡灌洗液中NO的濃度
　　 來(lái)自于iNOS的NO是一種與組織損傷相關(guān)的毒性分子。我們檢測(cè)了BLM處理鼠BALF中NO含量。與陰性對(duì)照相比，BLM誘導(dǎo)PF模型組NO水平增加。OM治療顯著抑制BLM誘導(dǎo)BALF中NO水平上升(P＜0.01，n=5)。這種抑制作用呈劑量依賴(lài)性。
　　 （二）氧化苦參堿可以抑制肺組織中iNOS表達(dá)
　　 首先應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)肺

15、組織中iNOS表達(dá)。陰性組，在少量的肺泡巨噬細(xì)胞可以微弱的發(fā)現(xiàn)iNOS陽(yáng)性信號(hào)。在BLM滴注22天后，在肺泡上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞可明顯地觀察到iNOS陽(yáng)性信號(hào)。而OM在20和40 mg/kg劑量顯著減弱BLM誘導(dǎo)的肺組織中iNOS表達(dá)的上升，而在10 mg/kg劑量幾乎沒(méi)有看到iNOS表達(dá)下降。
　　 為了進(jìn)一步確定在BLM誘導(dǎo)鼠PF中iNOS表達(dá)，分別應(yīng)用RT-PCR和westernblot分析檢測(cè)iNOS

16、mRNA和蛋白水平。與陰性對(duì)照比較，在BLM組，iNOS mRNA水平明顯增加。OM應(yīng)用呈劑量依賴(lài)性減弱BLM誘導(dǎo)PF中鼠肺組織的iNOSmRNA(P＜0.01，n=5)。與此同時(shí)，westemblot分析觀察到的變化與RT-PCR相一致。
　　 結(jié)論：
　　 在BLM誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型中
　　 一、氧化苦參堿可以減輕小鼠肺組織病理改變。
　　 二、氧化苦參堿通過(guò)抑制肺組織MPO活性及肺泡灌洗液中TNF