芪丹顆粒劑對(duì)博來霉素致大鼠肺纖維化微血管增生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肺纖維化是多種原因引起的慢性肺疾病的共同結(jié)局，是呼吸衰竭的主要病理基礎(chǔ)，其病理特點(diǎn)是肺部炎癥導(dǎo)致肺泡持續(xù)性損傷及細(xì)胞外基質(zhì)的反復(fù)破壞、修復(fù)、重建和過度沉積，是呼吸內(nèi)科四大病譜(感染性肺疾病、阻塞性肺疾病、腫瘤性肺疾病、間質(zhì)性肺疾病)之一。目前尚無有效治療，臨床上多用糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑為主，易產(chǎn)生較嚴(yán)重的藥物副作用。確診后五年生存率低于50﹪。肺纖維化發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，至今尚未完全闡明。既往認(rèn)為慢性炎癥在肺纖維化的發(fā)病機(jī)制中占主導(dǎo)

2、地位，但基于此理論的抗炎、免疫抑制治療并不理想。近年來，細(xì)胞因子的研究取得了重大進(jìn)步，明確了許多細(xì)胞因子在肺纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用，但并不能完全解釋肺纖維化發(fā)病中的所有現(xiàn)象。現(xiàn)階段，微血管醫(yī)學(xué)作為一門新興學(xué)科，越來越受到人們的重視。微血管的損傷、新生及調(diào)控障礙在纖維化病灶中的地位得到認(rèn)可。肺組織廣泛肺損傷后可能有利于血管新生重構(gòu)的組織微環(huán)境存在，持續(xù)存在的促進(jìn)血管新生微環(huán)境導(dǎo)致血管增生過度，而炎性細(xì)胞活化、成纖維細(xì)胞增生、合成大量膠原

3、纖維和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積均依賴于血管生成提供必需的營(yíng)養(yǎng)。改善微循環(huán)，活血化瘀，控制損傷后修復(fù)在正常范圍內(nèi)，防止膠原的過度形成，可能是治療纖維化的一個(gè)嶄新途徑。 芪丹顆粒劑是中藥的復(fù)合制劑，具有益氣活血化瘀，改善微循環(huán)的功能，并在長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用中取得了滿意的療效。本課題選用氫化可的松為對(duì)照組，通過VG染色和肺組織羥脯氨酸含量測(cè)定來觀察芪丹顆粒劑對(duì)博來霉素致肺纖維化大鼠膠原含量的影響，采用免疫組化法(Ⅷ因子)計(jì)數(shù)微血管，測(cè)定微血管密度

4、(MVD)，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)及缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的蛋白表達(dá)情況，探討微血管增生在纖維化形成中的作用，觀察VEGF和HIF-1α在微血管形成中的改變，以及VEGF與HIF-1α和MVD之間的相互關(guān)系，尋找微血管形成的始動(dòng)因素，探討芪丹顆粒劑治療肺纖維化的作用機(jī)理。 目的： 1、采用VG染色法，以及肺組織勻漿羥脯氨酸定量法，觀察芪丹顆粒劑對(duì)博來霉素致大鼠肺纖維化膠原

5、代謝的影響，并與氫化可的松相比較，觀察芪丹顆粒劑對(duì)肺纖維化的干預(yù)作用。 2、采用Ⅷ因子抗體免疫組化標(biāo)記肺血管，顯微鏡下計(jì)算微血管，測(cè)定微血管密度(MVD)，免疫組化法測(cè)定VEGF與HIF-1α的蛋白表達(dá)，探討微血管增生在肺纖維化中的作用。用LeicaQwinV3分析軟件對(duì)VEGF與HIF-1α蛋白表達(dá)量行灰度值測(cè)定，用SPSS11.5軟件對(duì)VEGF與HIF-1α、MVD之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。尋找微血管形成的始動(dòng)因素，探討芪丹顆粒

6、劑治療肺纖維化的作用機(jī)理。 方法： 1、160只健康雄性清潔級(jí)大鼠，隨機(jī)區(qū)組分為健康對(duì)照組(N)，博來霉素模型組(B)，氫化考的松組(H1、H2)，芪丹顆粒劑組(Q1，Q2)。用2﹪戊巴比妥鈉(0.2ml/100g)腹腔內(nèi)注射麻醉，在額鏡注視下將硬脊膜麻醉導(dǎo)管插入氣管，緩慢注入0.4﹪博來霉素0.25ml(5mg/Kg，4mg/ml)，注藥后立即將動(dòng)物直立旋轉(zhuǎn)，使藥物在肺內(nèi)分布均勻，制成肺間質(zhì)纖維化模型。造模次日開始，N

7、組、Q1組、H1組每日分別給予生理鹽水灌胃(2ml/只)、芪丹顆粒劑(3125mg/kg，用生理鹽水溶解，每只大鼠1.2-2.5ml)灌胃，氫化可的松瑚珀酸鈉(25mg/kg)腹腔注射；Q2組、H2組于造模第15日開始分別給于芪丹顆粒劑灌胃和氫化考的松腹腔注射(劑量同1組)。6組動(dòng)物均在第7天、14天、28天、42天隨機(jī)處死5只(N組)和10只(B組、M組、Q組)。具體分組、處死情況見表1。取大鼠右肺中葉，10﹪福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟

8、包埋。用蘇木素-伊紅(HE)評(píng)價(jià)肺組織病理學(xué)變化。 2、VG染色觀察肺組織中膠原含量、分布和形態(tài)學(xué)變化，肺組織勻漿羥脯氨酸定量法測(cè)定肺組織中膠原含量。 3、采用Ⅷ因子抗體免疫組化標(biāo)記肺血管，顯微鏡下計(jì)算微血管，測(cè)定微血管密度(MVD)。 4、觀測(cè)纖維化大鼠肺組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、缺氧誘導(dǎo)因子-1α蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)改變。 5、用LeicaQwinV3分析軟件測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子與缺氧誘導(dǎo)因子-1α表

9、達(dá)的灰度值，用SPSS11.5軟件對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子與微血管密度之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。 結(jié)果： 1、博來霉素致大鼠肺纖維化肺組織病理顯示：芪丹顆粒劑組肺胞炎及肺纖維化程度均明顯低于模型組和氫可組(P＜0.05)。 2、觀察VG染色、測(cè)定肺組織勻漿中羥脯氨酸含量，觀察肺組織膠原含量的變化。結(jié)果顯示：芪丹顆粒劑組膠原含量低于氫化可的松組(P＜0.01)。 3、大鼠肺組織Ⅷ因子相關(guān)抗原染色測(cè)定微血管密度：博

10、來霉素致傷大鼠后，肺組織中新生血管增多，14天時(shí)達(dá)高峰，此后隨著膠原纖維沉積，肺組織正常結(jié)構(gòu)基本消失，被膠原纖維沉積，少見血管。模型組血管增多明顯，小血管形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，多有不同程度的擴(kuò)張。14天組芪丹組與模型組比較，MVD明顯減輕(P＜0.05)，芪丹組與氫可組比較有非常顯著性差異(P＜0.05)。 4、免疫組織化學(xué)染色(S-P法)觀察到VEGF蛋白陽性表達(dá)為棕黃色顆粒，主要位于細(xì)胞胞漿，胞膜也有表達(dá)。在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞

11、(ATEⅡ)、支氣管上皮細(xì)胞、血管周圍平滑肌細(xì)胞、肺胞巨噬細(xì)胞，和少量的肺內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)也可見VEGF蛋白表達(dá)。正常對(duì)照組無明顯陽性表達(dá)。各實(shí)驗(yàn)組7天時(shí)VEGF蛋白陽性表達(dá)增高，14天時(shí)達(dá)到高峰，28天后VEGF表達(dá)明顯減少。14天時(shí)芪丹組與模型組、氫考組比較有非常顯著性差異，P＜0.01。28天時(shí)芪丹組與模型組、氫考組比較有顯著性差異，P＜0.05。 5、HIF-1α在大鼠肺組織中的表達(dá)，7天時(shí)各組之間HIF-1α陽性信號(hào)表達(dá)無

12、明顯差異。14天時(shí)芪丹組HIF-1α陽性信號(hào)輕度表達(dá)，芪丹組與模型組、氫考組之間有顯著性差異，P＜0.05。28天時(shí)芪丹組與氫考組比較，有顯著性差異P＜0.05。42天時(shí)表達(dá)降低接近正常，各組之間無明顯差異。 6、LeicaQwinV3分析軟件對(duì)纖維化大鼠肺組織中VEGF與MVD、HIF-1α蛋白表達(dá)相關(guān)性分析顯示：纖維化大鼠肺組織中HIF-1α與VEGF蛋白表達(dá)之間存在一致性，VEGF與MVD兩者表達(dá)有顯著性正相關(guān)，14天、2

13、8天時(shí)芪丹組與模型組、氫可組之間有非常顯著的相關(guān)性。 結(jié)論： 1、VG染色和肺組織均漿羥脯氨酸測(cè)定顯示：芪丹顆粒劑、氫化可的松均可減輕博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺組織膠原沉積，并且有逆轉(zhuǎn)纖維化的作用。芪丹顆粒劑作用優(yōu)于氫化可的松。 2、大鼠肺組織中微血管密度與博來霉素致大鼠肺纖維化密切相關(guān)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、缺氧誘導(dǎo)因子-1α的高表達(dá)與血管內(nèi)皮損傷相一致，可能是博來霉素誘發(fā)大鼠肺纖維化的重要啟動(dòng)因子之一。 3