重組人血管內(nèi)皮抑素在博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠模型中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、重組人血管內(nèi)皮抑素在博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠模型中的作用及機(jī)制研究
　　 研究背景與目的:
　　 特發(fā)性肺纖維化(idiopathicpulmonaryfibrosis，IPF)是最常見(jiàn)的肺間質(zhì)疾病，也是呼吸系統(tǒng)最嚴(yán)重疾病之一，病程一般呈進(jìn)行性發(fā)展，最終可以引起呼吸衰竭而死亡，其5年生存率不超50％，因此受到許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。IPF發(fā)病機(jī)制不明，治療效果差。研究其發(fā)病機(jī)制，拓展新的治療措施具有重要意義。
　　

2、 近年來(lái)血管生成在肺纖維化發(fā)生中的作用日益受到重視，血管生成可能是肺纖維化形成過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。很多研究發(fā)現(xiàn)在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化動(dòng)物模型中，抑制促血管生成因子或給予抗血管生成因子干預(yù)減輕血管生成能改善肺纖維化的進(jìn)展。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是目前已知的最主要的血管生成因子，能夠促進(jìn)新血管的生成，增加血管通透性，并參與炎細(xì)胞浸潤(rùn)、維持其存活和促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(

3、transforminggrowthfactorβ1，TGFβ1)表達(dá)等，VEGF受體2(vascularendothelialgrowthfactorreceptor2，VEGFR2)是VEGF發(fā)揮功能的主要受體。VEGF在肺纖維化形成中過(guò)度表達(dá)。抑制VEGF/VEGFR2通路可能通過(guò)抑制異常血管生成改善肺纖維化。
　　 VEGF能激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularsignalregulatedkinase，E

4、RK)。ERK1/2是目前發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要的細(xì)胞增殖信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白，能調(diào)控血管內(nèi)皮形態(tài)及多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子的表達(dá)。ERK1/2激活后可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子包括核因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)，進(jìn)而調(diào)控下游蛋白轉(zhuǎn)錄表達(dá)。NF-κB在炎癥反應(yīng)調(diào)控中起核心作用，參與調(diào)控許多細(xì)胞因子表達(dá)，包括促炎因子腫瘤壞死因子-α(tumournecrosisfactor-α，TNF-α)和促纖維化因子TGFβ1

5、。
　　 內(nèi)皮抑素能抑制VEGF/VEGFR2通路，在其他疾病研究中對(duì)于抑制ERK1/2和NF-κB活化、下調(diào)TNF-α和TGFβ1表達(dá)的作用也有報(bào)道?；谝陨贤芳凹?xì)胞因子在肺纖維化過(guò)程中的重要作用，推測(cè)應(yīng)用內(nèi)皮抑素干預(yù)血管形成及炎癥反應(yīng)可能改善肺纖維化進(jìn)展。本研究將建立博來(lái)霉素(bleomycin，BLM)誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型，給予重組人血管內(nèi)皮抑素(recombinanthumanendostatin，rhES)皮下注射

6、，觀察血管形成、炎癥及纖維化改變，探討內(nèi)皮抑素對(duì)肺纖維化的可能的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.肺纖維化模型建立:將博來(lái)霉素經(jīng)氣管注入SD大鼠，觀察動(dòng)物一般情況及不同時(shí)期肺組織切片HE染色及Masson染色，確定成功制備肺損傷纖維化模型。
　　 2.對(duì)血管形成、炎癥及肺纖維化的影響:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為正常對(duì)照組(生理鹽水，SAgroup)，博來(lái)霉素模型組(BLMgroup)，早期rhES組(BLM+前14天rhES

7、，E-ESgroup)、晚期rhES組(BLM+后14天rhES，L-ESgroup)及全程rhES組(BLM+28天rhES，W-ESgroup)。每組15只大鼠，分別于7天、14天、28天各處死5只。應(yīng)用HE染色、Masson染色及羥脯氨酸測(cè)定研究肺纖維化大鼠模型肺損傷不同階段肺部炎癥及纖維化改變;測(cè)定支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，BALF)中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及Wright-Giemsa染色觀察白

8、細(xì)胞分類改變，并測(cè)定BALF蛋白與血清總蛋白濃度，計(jì)算血管通透指數(shù)(proteinpermeabilityindex，PPI);免疫組織化學(xué)方法測(cè)量微血管密度(microvasculardensity，MVD)。
　　 3.機(jī)制研究:免疫組織化學(xué)方法測(cè)定VEGFR2蛋白表達(dá);酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linkedimmunesorbentassay，ELISA)分別測(cè)量肺組織勻漿VEGF、TGF-β1及BALF中TNF-α表達(dá)

9、。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析VEGF、VEGFR2mRNA水平表達(dá);Westernblot法分析ERK1/2及NF-κB的激活。
　　 4.結(jié)果統(tǒng)計(jì):應(yīng)用軟件SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，所有計(jì)量數(shù)據(jù)都用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，采用雙因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.動(dòng)物模型建立:正常大鼠鏡下見(jiàn)肺結(jié)構(gòu)清晰正常，各觀察時(shí)期無(wú)結(jié)構(gòu)改變，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原纖維沉積。給予博

10、來(lái)霉素氣管內(nèi)灌注后，第7天見(jiàn)肺泡間隔增寬，病灶區(qū)域內(nèi)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，少量膠原纖維沉積;14天肺泡間隔明顯增寬，仍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)但較前減輕，成纖維細(xì)胞及膠原纖維增多;第28天可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)破壞紊亂，肺間質(zhì)纖維成分大量沉積，炎癥細(xì)胞較前減少。
　　 2.動(dòng)物一般情況觀察:SA組大鼠活潑強(qiáng)壯，皮毛光亮，攝食正常，體重逐漸增加;BLM組死亡1只，有咳喘，皮毛無(wú)光澤，精神差，攝食減少，體重較SA組明顯下降(P＜0

11、.001)，后期體重略有增加。E-ES和W-ES組大鼠早期有咳喘，攝食減少，體重下降較BLM組減少(P＜0.05);L-ES組大鼠表現(xiàn)同BLM組，體重變化較BLM組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3.病理學(xué)改變:SA組各觀察時(shí)期肺組織無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維沉積。BLM組早期見(jiàn)肺泡間隔增寬，病灶區(qū)域炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，少量膠原纖維沉積;晚期肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺間質(zhì)內(nèi)大量藍(lán)色膠原纖維沉積，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較早期減少。E-ES和W-ES組HE染色及

12、Masson染色顯示第7、14天肺泡炎較BLM組明顯減輕（day7:P＜0.001，day14:P＜0.05），纖維化評(píng)分第14、28天較BLM組明顯減低（day14:P＜0.05，day28:P＜0.001）。L-ES組大鼠肺泡炎及纖維化評(píng)分較BLM組大鼠無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4.羥脯氨酸測(cè)定:SA組大鼠肺羥脯氨酸含量各觀察時(shí)間段無(wú)明顯變化。BLM造模后各觀察時(shí)間段均較SA組明顯升高（P＜0.001）。E-ES和W-ES組

13、羥脯氨酸含量較BLM組均明顯下降(day7:P＜0.01，day14和day28:P＜0.001)。L-ES組羥脯氨酸含量較BLM組低，但尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(day28:P=0.09)。
　　 5.MVD:SA組各觀察時(shí)間段肺微血管密度無(wú)明顯變化。BLM造模后第7天新生血管明顯增多，第14和28天逐漸下降(P＜0.001)。E-ES和W-ES組各觀察時(shí)間段MVD較BLM組降低，L-ES組MVD較BLM組無(wú)明顯變化。
　　 6

14、.BALF炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類:SA組各觀察時(shí)間段BALF炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類無(wú)變化。BLM造模后BALF中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯升高（P值均＜0.05）。E-ES和W-ES組第7和14天白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)較BLM組均明顯下降（P＜0.05），淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)在各觀察時(shí)間段較BLM組無(wú)明顯變化。L-ES組炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類較BLM組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 7.PPI:SA組各觀察時(shí)間段PPI

15、無(wú)變化。BLM組PPI第7天明顯升高，第14和28天逐漸下降（P＜0.001）。E-ES和W-ES組PPI較BLM組降低（day7和day14:P＜0.001，day28:P＜0.05）。L-ES組PPI較BLM組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 8.VEGF及VEGFR2mRNA與蛋白水平表達(dá)變化:BLM組各觀察時(shí)段VEGF及VEGFR2mRNA水平較SA組明顯增高，以第7天為著，第14和28天逐漸下降(day7和day14:P＜0.00

16、1,day28:P＜0.05)。E-ES和W-ES組VEGF/VEGFR2mRNA表達(dá)較BLM組降低（P值均＜0.05）。L-ES組VEGF及VEGFR2mRNA表達(dá)較BLM組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。肺勻漿VEGF濃度及VEGFR2免疫組化評(píng)分變化同mRNA水平變化。
　　 9.TNF-α表達(dá):SA組各觀察時(shí)間段TNF-α表達(dá)水平無(wú)明顯變化。BLM造模后TNF-α第7天明顯升高，第14和28天逐漸下降(P＜0.001);E-ES和W-ES

17、組TNF-α水平較BLM組在各觀察時(shí)期均明顯下降(P＜0.001);L-ES組第28天TNF-α水平較BLM組也下降（P＜0.05）。
　　 10.TGF-β1表達(dá):BLM組TGF-β1表達(dá)較SA組明顯升高，第14天最顯著，第28天略有下降（P＜0.001）;早期應(yīng)用內(nèi)皮抑素能顯著抑制TGF-β1升高(P＜0.001);晚期應(yīng)用內(nèi)皮抑素后TGF-β1表達(dá)較BLM組降低，但尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（day28:P=0.142）。
　　

18、 11.pERK1/2和總ERK1/2:BLM造模后各組pERK1/2表達(dá)均較SA組明顯升高(P值均＜0.05);E-ES和W-ES組pERK1/2表達(dá)第7、14天明顯低于BLM組和L-ES組（day7:P＜0.001，day14:P＜0.05），第28天各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;L-ES組和BLM組各觀察時(shí)間段pERK1/2表達(dá)無(wú)顯著差異?？侲RK1/2在各組各觀察時(shí)間段內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定無(wú)顯著變化。
　　 12.NF-κB激活:SA組N

19、F-κB活化單位p65少量表達(dá)且各時(shí)期無(wú)明顯變化。BLM造模后p65表達(dá)明顯增多且第14天達(dá)到高峰，第28天有所下降。E-ES和W-ES組各觀察時(shí)間段p65表達(dá)較BLM組明顯下降(P＜0.05);L-ES組和BLM組各觀察時(shí)間段p65表達(dá)尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（day28:P=0.139）。
　　 結(jié)論:
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠氣管內(nèi)注入博來(lái)霉素后成功建立肺纖維化動(dòng)物模型，肺組織病理特點(diǎn)說(shuō)明可用于肺間質(zhì)纖維化的研究。早期開(kāi)始應(yīng)用內(nèi)