雙氫青蒿素抑制博來(lái)霉素致肺纖維化大鼠炎癥、纖維化及氧化應(yīng)激過(guò)程的研究.pdf

1、肺纖維化(PF)是近年發(fā)病率有上升趨勢(shì)的一種彌漫性間質(zhì)性肺疾病，發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，進(jìn)展迅速，病死率高。臨床觀察和實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PF在發(fā)生發(fā)展中，除了涉及細(xì)胞（凋亡、轉(zhuǎn)型）、細(xì)胞因子（TGF-β，TNF-α，IFN-γ等）及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB等機(jī)制外，還有研究表明在這個(gè)過(guò)程中存在明顯的氧化應(yīng)激狀態(tài)。甚至有學(xué)者提出活性氧可能是肺纖維化患者組織損傷的真正原因。因此，深入探討IPF發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的這些機(jī)制并加以調(diào)控，對(duì)治療本病將具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)

2、實(shí)意義。
　　青蒿素是用菊科植物黃花蒿葉提取的，青蒿琥酯、雙氫青蒿素等是其衍生物，發(fā)現(xiàn)這些衍生物具有抗炎、抗組織纖維化及免疫調(diào)節(jié)等作用。因此本研究建立博來(lái)霉素致大鼠肺纖維化動(dòng)物模型，并分別與地塞米松及N-乙酸半胱氨酸的療效作對(duì)比，探討雙氫青蒿素對(duì)博來(lái)霉素致肺纖維化大鼠的干預(yù)作用及對(duì)炎癥、膠原纖維合成及氧化應(yīng)激過(guò)程的影響，為有效防治肺纖維化提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　第一部分:雙氫青蒿素對(duì)博來(lái)霉素致肺纖維化大鼠的干預(yù)作用
　　方

3、法:健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠54只，隨機(jī)分為6組，每組9只。分組如下：
　?、僬?duì)照組(NS組): NS組于造模實(shí)驗(yàn)當(dāng)天氣管內(nèi)一次性注射與BLM組等體積生理鹽水，第2日起每日腹腔注射等體積生理鹽水;②博來(lái)霉素模型組(BLM組):BLM組于造模實(shí)驗(yàn)當(dāng)天氣管內(nèi)一次性注射含博來(lái)霉素的生理鹽水5mg/kg(濃度4mg/ml)，第2日起每日腹腔注射等體積生理鹽水;③雙氫青蒿素低劑量治療組(DHA-1組):DHA-1組于造模實(shí)驗(yàn)當(dāng)天氣

4、管內(nèi)一次性注射含博來(lái)霉素的生理鹽水5mg/kg(濃度4mg/ml)，第2日起每日腹腔注射DHA(25mg/kg·d);④雙氫青蒿素中劑量治療組(DHA-2組):DHA-2組于造模實(shí)驗(yàn)當(dāng)天氣管內(nèi)一次性注射含博來(lái)霉素的生理鹽水5mg/kg(濃度4mg/ml)，第2日起每日腹腔注射DHA(50mg/kg·d);⑤雙氫青蒿素高劑量治療組(DHA-3組):DHA-3組于造模實(shí)驗(yàn)當(dāng)天氣管內(nèi)一次性注射含博來(lái)霉素的生理鹽水5mg/kg(濃度4mg/ml

5、)，第2日起每日腹腔注射DHA(100mg/kg·d);⑥地塞米松治療組(DXM組):DXM組于造模實(shí)驗(yàn)當(dāng)天氣管內(nèi)一次性注射含博來(lái)霉素的生理鹽水5mg/kg(濃度4mg/ml)，第2日起每日腹腔注射DXM(3mg/kg·d)。
　　于造模后第7、14及28天，每組分別取3只大鼠進(jìn)行麻醉后處死，取左肺下葉固定于10％甲醛溶液行HE染色及MASSON染色觀察判斷肺泡炎及肺纖維化評(píng)分;剩余肺組織入深低溫冰箱保存進(jìn)行肺組織羥脯氨酸含量的檢

6、測(cè)。
　　結(jié)果:①肺泡炎評(píng)分:BLM組、DHA-1，2，3組及DXM組的肺泡炎評(píng)分在第7及14d均比NS組高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); DHA-1，2，3組及DXM組的肺泡炎評(píng)分在第7及14d均比BLM組的評(píng)分低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); DHA-1組與DXM組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); DHA-2，3組與DXM組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。②肺纖維化評(píng)分:BLM組、DHA-1，2，3組及DX

7、M組的肺纖維化評(píng)分在第14及28d均比NS組高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;DHA-1，2，3組及DXM組的肺纖維化評(píng)分在第14及28 d均比BLM組的評(píng)分低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); DHA-2，3組與DXM組相比較，在第7及14d的差異有顯著性意義(P＜0.05); DHA-1組與DXM組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。DHA-2和DHA-3組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。③肺組織中HYP含量的檢測(cè):

8、DHA-1，2，3組和DXM組在第14及28天的含量均明顯低于BLM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); DHA-2，3組與DXM組相比較，在第14及28d的差異有顯著性意義(P＜0.05); DHA-1組與DXM組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）;DHA-2和DHA-3組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）;在第7天六組間的差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05）。
　　第二部分:雙氫青蒿素對(duì)博來(lái)霉素致肺纖維化大鼠TGF-β1，

9、TNF-α，α-SMA和NF-κB表達(dá)的影響
　　方法:動(dòng)物分組及造模同實(shí)驗(yàn)一。
　　于造模后第7、14及28天，每組分別取3只大鼠進(jìn)行麻醉后處死，取左肺下葉固定于10％甲醛溶液行HE染色及MASSON染色觀察判斷肺泡炎及肺纖維化評(píng)分;取左肺剩余組織固定于10％甲醛溶液，進(jìn)行TGF-1，TNF-α，α-SMA和NF-κB的免疫組織化學(xué)染色觀察;右肺肺組織入深低溫冰箱保存，分別采用Western blotting和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶

10、鏈反應(yīng)(RT-PCR)法進(jìn)行TGF-β1，TNF-α，α-SMA和NF-κB的蛋白和mRNA表達(dá)的檢測(cè)。
　　結(jié)果:①免疫組織化學(xué)染色結(jié)果:BLM組、DHA-1，2，3組及DXM組的肺組織TGF-β1，TNF-α，α-SMA和NF-κB的表達(dá)在第7、14及28 d均比NS組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); DHA-1，2，3組及DXM組的TGF-β1，TNF-α，α-SMA和NF-κB的表達(dá)在在第7、14及28 d均比BLM

11、組的低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); DHA-2，3組與DXM相比較，差異有顯著性意義(P＜0.05); DHA-1組與DXM組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05); DHA-2和DHA-3組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。②Western blotting檢測(cè)結(jié)果:DHA-1，2，3組及DXM組的TGF-β1，TNF-α，α-SMA和NF-κB的表達(dá)在第7、14及28 d均比BLM組的低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

12、; BLM組、DHA-1，2，3組、BLM組及DXM組的肺組織TGF-β1，TNF-α，α-SMA和NF-κ B的表達(dá)在第7、14及28 d均比NS組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;DHA-2，3組與DXM相比較，在第7、14及28 d的差異均有顯著性意義(P＜0.05); DHA-1組與DXM組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05); DHA-2和DHA-3組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。③RT-PCR檢測(cè)結(jié)果:DHA-

13、1，2，3組及DXM組的TGF-β1，TNF-α，α-SMA和NF-κB mRNA的含量在在第7、14及28 d均比BLM組的低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); BLM組、DHA-1，2，3組及DXM組的肺組織TGF-β1，TNF-α，α-SMA和NF-κB mRNA的含量在第7、14及28 d均比NS組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DHA-2，3組與DXM相比較，差異有顯著性意義（P＜0.05）。DHA-1組與DXM組的差

14、異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。DHA-2和DHA-3組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。
　　第三部分:雙氫青蒿素對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肺纖維化氧化應(yīng)激過(guò)程的影響
　　方法:健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為4組，每組15只。分組如下：
　?、僬?duì)照組(NS組): NS組于造模實(shí)驗(yàn)當(dāng)天氣管內(nèi)一次性注射與BLM組等體積生理鹽水，第2日起每日腹腔注射等體積生理鹽水;②博來(lái)霉素模型組(BLM組):BLM組于造模

15、實(shí)驗(yàn)當(dāng)天氣管內(nèi)一次性注射含博來(lái)霉素的生理鹽水5mg/kg(濃度4mg/ml)，第2日起每日腹腔注射等體積生理鹽水;③雙氫青蒿素治療組(DHA組):DHA組于造模實(shí)驗(yàn)當(dāng)天氣管內(nèi)一次性注射含博來(lái)霉素的生理鹽水5mg/kg(濃度4mg/ml)，第2日起每日腹腔注射DHA(50mg/kg·d);④N-乙酸半胱氨酸（NAC組）:NAC組于造模實(shí)驗(yàn)當(dāng)天氣管內(nèi)一次性注射含博來(lái)霉素的生理鹽水5mg/kg(濃度4mg/ml)，第2日起每日腹腔注射NAC(

16、400mg/kg·d)。
　　于造模后第7、14及28天，每組分別取5只大鼠進(jìn)行麻醉后處死。取左肺下葉固定于10％甲醛溶液行HE染色及MASSON染色觀察判斷肺泡炎及肺纖維化評(píng)分;其余肺組織入深低溫冰箱保存，進(jìn)行丙二醛(MDA)，谷胱甘肽（GSH）及超氧化物歧化酶(SOD)含量的檢測(cè)。
　　結(jié)果:①肺泡炎與肺纖維化評(píng)分:同實(shí)驗(yàn)一。②肺組織中GSH與SOD檢測(cè)結(jié)果:二者在DHA組及DXM組的表達(dá)在第14及28 d均比BLM組的

17、高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;而B(niǎo)LM組、DHA組及DXM組的表達(dá)在第7、14及28 d均比NS組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。③肺組織中MDA檢測(cè)結(jié)果:在DHA組及DXM組的表達(dá)在第14及28 d均比BLM組的低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;而B(niǎo)LM組、DHA組及DXM組的表達(dá)在第7、14及28 d均比NS組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　全文結(jié)論：1、雙氫青蒿素抑制博來(lái)霉素致大鼠肺纖維化模型的

18、纖維化病變，其療效在劑量≥50mg/kg·d時(shí)（腹腔注射用藥）優(yōu)于地塞米松。
　　2、雙氫青蒿素在轉(zhuǎn)錄與翻譯水平上抑制博來(lái)霉素致大鼠肺纖維化模型肺組織中TGF-β1，TNF-α，α-SMA和NF-κB的表達(dá)，說(shuō)明其療效與抑制病變過(guò)程的炎癥與肌成纖維細(xì)胞活動(dòng)有關(guān)。
　　3、雙氫青蒿素干預(yù)實(shí)驗(yàn)性大鼠肺纖維化氧化應(yīng)激過(guò)程，MDA含量降低;GSH與SOD含量升高，糾正氧化-抗氧化失衡。
　　4、雙氫青蒿素可作為潛在的治療肺纖維