阿奇霉素對博來霉素致小鼠肺纖維化中ILK及β-catenin蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、博來霉素（Bleomycin, BLM）是一種氨基糖苷類天然產(chǎn)物，由梅澤賓夫等于1966年從輪枝鏈霉菌的培養(yǎng)液分離得到，至今臨床應(yīng)用已經(jīng)50余年，抗癌活性強(qiáng)，尤其對淋巴癌、磷狀細(xì)胞癌、肺癌和生殖系統(tǒng)癌癥具有很好的療效，同時無明顯的骨髓抑制，不抑制機(jī)體的免疫功能，使其成為臨床腫瘤化療的重要藥物，但其嚴(yán)重的肺纖維化毒副作用，極大的限制了臨床足量足療程應(yīng)用。因此如何在保證BLM足量足療程應(yīng)用的基礎(chǔ)上，防治肺纖維化是進(jìn)一步改善腫瘤患者預(yù)后的關(guān)鍵

2、。
　　整合素連接激酶（integrin-linked kinase, ILK）是運用酵母雙雜交技術(shù)鑒定獲得的一種具有蛋白激酶活性的新蛋白質(zhì)，在多種生長因子信號通路中發(fā)揮重要作用，活化后的ILK可以調(diào)控其下游的靶標(biāo)蛋白，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、生長、分化、遷移、浸潤以及腫瘤血管生成等過程。上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epitelial-mesenchymal transition, EMT）是肺纖維化的重要過程，多項研究表明ILK與細(xì)胞的EMT

3、密切關(guān)聯(lián)，促進(jìn)EMT發(fā)生發(fā)展?；罨蟮腎LK介導(dǎo)α-平滑肌蛋白表達(dá)上調(diào)，從而參與EMT的形成。
　　新近研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路同樣可以參與多器官的纖維化過程。Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是肺部發(fā)育所必需的分子信號系統(tǒng)，其表達(dá)異常與肺纖維化亦密切相關(guān)，該通路參與纖維化主要與β-連環(huán)蛋白的核聚集相關(guān)。當(dāng)β-catenin磷酸化被抑制時，導(dǎo)致其無法被泛素識別，從而不能被蛋白酶復(fù)合體降解，進(jìn)而在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量集聚并

4、發(fā)生核聚集，導(dǎo)致組織纖維化。新近研究發(fā)現(xiàn)β-catenin與ILK存在重要對話：β-catenin的核聚集與糖原合成激酶3β(Gkycogen synthase kinase-3 beta,GSK-3β)的磷酸化有關(guān)，同時Virchows等研究表明，活化后的ILK亦可以影響GSK-3β的磷酸化，因此二者在肺纖維化中可能存在協(xié)同作用。
　　肺纖維化是一種進(jìn)行性加重的間質(zhì)性肺部病變，病理表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎、肺泡單位結(jié)構(gòu)紊亂和肺纖維化，

5、其確切發(fā)病機(jī)制仍不清楚。大致為化學(xué)或其他原因觸發(fā)肺部炎癥，隨后出現(xiàn)滲出、纖維母細(xì)胞增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積，最終導(dǎo)致不可逆性肺損傷，目前雖然仍無特性藥物治療，但國內(nèi)外一個重大突破發(fā)現(xiàn)，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素能夠阻止纖維化疾病發(fā)展，甚至可以改善肺功能。何坤等研究發(fā)現(xiàn)，紅霉素可以預(yù)防博來霉素導(dǎo)致的肺纖維化。牛曉娟等研究發(fā)現(xiàn)阿奇霉素能夠減輕肺纖維化大鼠模型中膠原沉積，具有與地塞米松相似的作用，且不良反應(yīng)少。但大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抗纖維化的具體機(jī)制仍處

6、于探索之中。
　　目的：
　　本文通過博來霉素復(fù)制小鼠肺纖維化模型，予阿奇霉素干預(yù)，觀察小鼠肺組織病理改變及ILK和β-catenin含量變化，探討阿奇霉素在肺纖維化中的作用，并為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　選取清潔級健康昆明小鼠100只，體重18-22g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為A組(模型組)：20只，氣管內(nèi)一次性注入BLM（3.5mg/Kg，以1ml生理鹽水溶解），于造模后第1天生理鹽水1ml灌

7、胃，1次/d，共28天；B組(空白組)：20只，氣管內(nèi)注入1ml生理鹽水，于假造模后第1天生理鹽水1ml灌胃，1次/d，共28天。C組(阿奇霉素干預(yù)組Ⅰ)：20只，氣管內(nèi)一次性注入BLM（3.5mg/Kg，以1ml生理鹽水溶解），于造模后第1天給予阿奇霉素5mg/Kg（1ml生理鹽水溶解）灌胃，1次/天，共14天。D組(阿奇霉素干預(yù)組Ⅱ):20只，氣管內(nèi)一次性注入BLM（3.5mg/Kg，以1ml生理鹽水溶解），于造模后第15天給予阿奇

8、霉素5mg/Kg（1ml生理鹽水溶解）灌胃，1次/天，共14天。E組(阿奇霉素干預(yù)組Ⅲ):20只，氣管內(nèi)一次性注入BLM（3.5mg/Kg，以1ml生理鹽水溶解），于造模后第1天給予阿奇霉素5mg/Kg（1ml生理鹽水溶解）灌胃，1次/天，共28天。以上各組分別于7、14、21、28天各處死5只。剪斷右側(cè)股動脈放血處死，處死后即刻取右肺勻漿，置于-70℃冰箱中，待標(biāo)本收集完成后，運用ELISA測定ILK、β-catenin蛋白含量。左肺

9、組織放于4％甲醛固定液后做HE染色及Masson染色，評價肺泡炎癥和肺纖維化的程度。
　　統(tǒng)計學(xué)分析：應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計數(shù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示，同一時間點，同一指標(biāo)的組間比較在滿足正態(tài)性及方差齊性下進(jìn)行獨立樣本T檢驗，不滿足正態(tài)性或方差齊性情況下進(jìn)行獨立樣本的非參數(shù)檢驗，兩變量相關(guān)采用Spearman等級相關(guān)分析，以P<0.05為檢驗標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　　1.肺組織病

10、理結(jié)果分析：
　　在相同時間點，A組小鼠肺泡炎及纖維化程度均顯著高于B組；C組和E組小鼠肺均有輕度肺泡炎及纖維化，兩組與A組比較，小鼠肺泡炎及纖維化程度均顯著減輕；D組小鼠肺組織實驗第7天及第14天可見與A組相同時間點同樣程度的肺泡炎癥及纖維化，給予阿奇霉素干預(yù)后，即第21天及第28天D組小鼠肺組織炎癥及纖維化較A組相同時間點明顯減輕。各組病理結(jié)果表明肺纖維化分為早期炎癥及晚期纖維化兩個階段，符合人肺纖維化病理過程，且炎癥反應(yīng)隨纖

11、維化進(jìn)展逐漸減輕，而纖維化程度逐漸加重。
　　2.肺組織中ILK、β-catenin含量：
　　2.1.組間比較
　　1）相同時間點：A組小鼠肺組織中的ILK、β-catenin含量較B組均明顯升高，尤以A組第28天升高最為顯著，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）；
　　2）相同時間點：C組小鼠肺組織中的ILK、β-catenin含量較A組均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）；
　　3）相同時

12、間點：D組小鼠肺組織中ILK、β-catenin含量在第7天、第14天較A組無明顯變化，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05）；在第21天、第28天肺組織中ILK、β-catenin含量較A組均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）；
　　4）相同時間點：E組小鼠肺組織中ILK、β-catenin含量較A組均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）；
　　5）相同時間點：C組小鼠肺組織中ILK、β-catenin

13、含量較E組均無明顯變化，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；
　　2.2.組內(nèi)比較
　　1）不同時間點：A組小鼠肺組織中ILK、β-catenin含量隨時間延長逐漸增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）；
　　2）不同時間點：B、C、E三組中，小鼠肺組織 ILK、β-catenin含量均無明顯變化，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05）；
　　3）不同時間點：D組小鼠肺組織中ILK、β-catenin含量在阿奇霉素干預(yù)前后均有

14、差異，即D組小鼠肺組織ILK、β-catenin含量在第7天、第14天與第21天、28天比較均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）。
　　3.肺組織中ILK、β-catenin的相關(guān)性分析：
　　不同時間點A組博來霉素模型組中，小鼠肺組織ILK、β-catenin的含量較B組空白組小鼠肺組織ILK、β-catenin的含量均明顯升高，二者呈正性相關(guān)，具有統(tǒng)計數(shù)意義（P<0.001，r＝0.978）
　　結(jié)論：