大蒜試管苗玻璃化發(fā)生的生理機(jī)制及microRNAs分析.pdf

1、大蒜(Allium sativum L.)是重要的藥食兼用蔬菜，在世界范圍廣泛栽培和食用。由于大蒜栽培種主要利用鱗莖進(jìn)行無性繁殖，極易產(chǎn)生病毒積累，從而導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降。利用組織培養(yǎng)技術(shù)脫毒是大蒜品種提純復(fù)壯的有效手段。然而大蒜試管苗培養(yǎng)過程中玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重，限制了這一技術(shù)在生產(chǎn)中的普遍應(yīng)用。
　　試管苗玻璃化是植物組織培養(yǎng)過程中普遍存在的一種生理障礙。玻璃化試管苗呈現(xiàn)半透明水浸狀，其組織結(jié)構(gòu)和生理功能異常，分化能力低下，難以成

2、芽和增殖，也難以生根成苗，移栽后成活率低，后期生長(zhǎng)差，對(duì)植物脫毒、快繁及基因遺傳轉(zhuǎn)化影響嚴(yán)重，但其發(fā)生機(jī)制至今尚未明確。
　　研究發(fā)現(xiàn)，在試管苗玻璃化過程中同時(shí)存在活性氧物質(zhì)(ROS)的產(chǎn)生和積累，更多的研究也證實(shí)試管苗玻璃化與活性氧代謝紊亂相關(guān)，但其相互關(guān)系及作用機(jī)理迄今少有報(bào)道。為了明確試管苗玻璃化過程中活性氧代謝特點(diǎn)，探究活性氧誘導(dǎo)試管苗玻璃化的生理和分子生物學(xué)機(jī)制，本研究以大蒜品種‘二水早’為材料，采用組織觀察、生理測(cè)定、

3、高通量測(cè)序等技術(shù)，從組織-細(xì)胞-分子等不同層次，探討活性氧與試管苗玻璃化、細(xì)胞器損傷、細(xì)胞膜異變和miRNAs及其靶基因表達(dá)的關(guān)系，進(jìn)而揭示試管苗玻璃化的機(jī)理。主要研究結(jié)果如下:
　　1.在培養(yǎng)基中添加不同濃度（0、0.5、1.0、1.5和2.0mM）外源H2O2，觀察不同濃度下大蒜試管苗玻璃化發(fā)生差異及其生理特點(diǎn)。與其他濃度相比，1.5mMH2O2作用下的試管苗玻璃化率最高。同時(shí)，1.5mM H2O2處理使試管苗的組織含水量顯著

4、增加，葉綠素及可溶性蛋白含量顯著降低。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，1.5 mM H2O2處理誘導(dǎo)試管苗產(chǎn)生了兩條新的蛋白譜帶，分子量分別為52 kD及110kD。同時(shí)，試管苗83 kD和105 kD的兩條蛋白譜帶表達(dá)量增強(qiáng)。
　　2.在培養(yǎng)基中添加1.5mMH2O2，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，試管苗玻璃化率顯著提高，玻璃化程度明顯加重，葉綠體和線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷，亞細(xì)胞水平超氧陰離子產(chǎn)生速率(O2·-)和內(nèi)源H2O2含量顯著提高。與其

5、他細(xì)胞器相比，質(zhì)外體抗氧化系統(tǒng)響應(yīng)脅迫最早，ROS產(chǎn)生和累積最顯著，說明質(zhì)外體在試管苗氧化脅迫和玻璃化發(fā)生過程中具有重要作用。
　　3.利用外源H2O2和二碘基苯(DPI，NADPH氧化酶抑制劑)、疊氮化鈉(NaN3，POD抑制劑)以及雙辛胍胺（GUA，PAO抑制劑）處理大蒜試管苗，發(fā)現(xiàn)外源H2O2處理使試管苗質(zhì)膜NADPH氧化酶、細(xì)胞壁POD及質(zhì)外體PAO的活性均顯著增加，而抑制NADPH氧化酶、POD及PAO活性能夠顯著降低氧

6、化脅迫下試管苗玻璃化率、O2·-產(chǎn)生速率和H2O2含量，其中DPI對(duì)試管苗產(chǎn)生O2·-的抑制作用顯著高于NaN3和GUA。在整個(gè)處理期間，外源H2O2使質(zhì)膜NADPH氧化酶活性始終呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而細(xì)胞壁POD及質(zhì)外體PAO活性短暫提高后逐漸降低，說明質(zhì)膜NADPH氧化酶是催化試管苗活性氧形成的重要氧化酶。
　　4.采用半液體培養(yǎng)、培養(yǎng)基中添加高濃度6-BA和外源H2O2誘導(dǎo)玻璃化試管苗，研究玻璃化苗細(xì)胞壁及細(xì)胞膜在結(jié)構(gòu)、組成及其功

7、能的異常變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常試管苗相比，玻璃化苗細(xì)胞壁纖維素、木質(zhì)素及果膠含量顯著降低，細(xì)胞膜不飽和脂肪酸指數(shù)和磷脂含量顯著降低;玻璃試管化苗細(xì)胞膜H+-ATPase活性、細(xì)胞膜流動(dòng)性及細(xì)胞膜Ca2+含量顯著低于正常試管苗。說明玻璃化試管苗細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與物質(zhì)組成發(fā)生異常變化，并由此導(dǎo)致其功能的異常。
　　5.利用在培養(yǎng)基添加外源H2O2和不添加H2O2，構(gòu)建氧化脅迫處理和正常培養(yǎng)（對(duì)照）2個(gè)小RNA文庫，利用miRNAs測(cè)

8、序技術(shù)，篩選和鑒定出大蒜試管苗響應(yīng)氧化脅迫的353條保守miRNAs和76條新miRNAs，其中133條miRNAs在氧化脅迫下是顯著上調(diào)表達(dá)，76條miRNAs顯著下調(diào)表達(dá)。同時(shí)進(jìn)行降解組測(cè)序和分析，發(fā)現(xiàn)21條保守miRNAs靶向26個(gè)靶基因家族，17條新miRNAs靶向3個(gè)基因家族。靶向蛋白質(zhì)水解酶及乙烯轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)miRNAs上調(diào)表達(dá)，靶向ATP和膜蛋白基因的相關(guān)miRNAs下調(diào)表達(dá)。由此推測(cè)，差異表達(dá)miRNAs的靶基因主要在