用于清除尿素延緩慢性腎衰的基因工程乳酸菌研究.pdf

1、腎衰竭是一種發(fā)病率很高的常見疾病。目前的治療方法包括血液透析和血液濾過有顯著療效，但是只有少數(shù)患者能夠承擔(dān)這兩種治療。為了開發(fā)出一種具有臨床應(yīng)用潛力，無毒副作用，可用于治療慢性腎衰竭的口服劑——工程菌療法，本研究將安全、益生的乳酸乳球菌Lactococcus Lactis subspMG1363作為工程化研究對象，通過外源脲酶基因修飾及馴化的手段，降解腸道中積累的多余的尿素。
　　 外源脲酶基因修飾Lactococcus Lac

2、tis subspMG1363是將Klebsiellaaerogenes中的脲酶基因片段克隆入pMG36e，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMG36eure，并轉(zhuǎn)化入L.Lactis MG1363，篩選鑒定。通過RT-PCR，Western-blotting，從轉(zhuǎn)錄和表達水平鑒定其表達。測定了脲酶基因修飾的E.ColiDH5α和L.Lactis MG1363降解尿素的能力。培養(yǎng)工程化的E.Coli DH5α12～16小時，可將尿素的濃度從30mg/dL下

3、降到12 mg/dL，下降57％；工程化的乳酸菌脲酶活性是pH和金屬Ni離子依賴的，在pH=6.5～7.5，Ni離子大于200μM時，培養(yǎng)脲酶基因修飾的乳酸菌19～24h，培養(yǎng)基尿素濃度從起始的32.61mg/dL下降到18.59 mg/dL，下降了43%。
　　 通過馴化方法逐漸增加培養(yǎng)基中的尿素濃度，減少其他氮源，傳代培養(yǎng)獲得以尿素為唯一氮源的乳酸菌，使Lactococcus Lactis subspMG1363能夠在富含尿

4、素的培養(yǎng)基中生長，使乳酸菌獲得在體外消耗和分解尿素的能力。獲得的馴化菌通過生理生化和16S RNA鑒定，確定菌株沒有被污染的情況下，可以在24小時內(nèi)，將培養(yǎng)基中的尿素濃度從40.01±1.94 mg/dL顯著降低到32.99±3.13mg/dL（清除率l7.5%）這些數(shù)據(jù)表明Lactococus lactis通過馴化獲得了分解尿素的能力，用NaHCO3緩沖乳酸菌培養(yǎng)過程中造成的pH的降低，添加200μM的Ni離子，優(yōu)化工程菌降解尿素的能

5、力，24小時的培養(yǎng)可以使培養(yǎng)基中的尿素濃度從40.09±0.76 mg/dL顯著降低到25.73±2.46 mg/dL（清除率35.8%）。
　　 對兩種途徑得到的工程菌在模擬胃腸環(huán)境中進行了研究，包括低pH(pH2.5～4.0)，含膽酸鈉鹽（濃度0.1%），對腸道中的微生物（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）以及抗生素的耐受性等。結(jié)果表明工程菌可以在酸性pH的條件下生存兩小時以上；繼而在O.1%高膽酸鹽濃度中生存6小時以上，并保持分解

6、尿素的能力；在模擬胃腸環(huán)境下脲酶基因修飾的Lactococcus Lactis subspMG1363培養(yǎng)10 h，尿素的清除率為30%；24 h后，清除率為65%；而馴化菌在模擬胃腸環(huán)境下，6個小時內(nèi)將培養(yǎng)基中的尿素從40.71±0.34 mg/dL降低到36.61±5.17 mg/dL，清除率10.1%。
　　 研究還發(fā)現(xiàn)乳酸菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有拮抗作用；對臨床常見的抗生素氨芐青霉素、四環(huán)素、慶大霉素、羅紅霉素和

7、頭孢拉定都具有明顯的抗生素抗性。適合作為生化制劑的優(yōu)良菌種。
　　 口服食品級工程菌降解尿素水平有可能成為治療慢性腎衰的一種新方法。為了評價工程菌的有效性和安全性，將工程菌及普通乳酸菌分別灌胃wistar大鼠（1個月），觀察動物的一般狀況，包括進水進食，體重，血液生化，血常規(guī)指標(biāo)等，并與正常大鼠進行比較．結(jié)果顯示，試驗組大鼠與正常進食的大鼠在以上觀察的指標(biāo)方面無顯著差異．說明工程乳酸菌是安全的。為了研究工程菌在體內(nèi)降低尿素水平和