油酸性肺損傷大鼠水通道蛋白4表達(dá)及特布他林對(duì)其的影響.pdf

1、目的：
　　旨在以油酸造成SD大鼠急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（ALI/ARDS）動(dòng)物模型為研究對(duì)象，通過(guò)血?dú)夥治?、觀察肺組織病理、肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞形態(tài)改變來(lái)評(píng)價(jià)早期肺組織損傷的程度,測(cè)定AQP4在肺組織及肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞表達(dá)，進(jìn)而觀察特布他林氣管滴入治療時(shí)，肺組織病理改變、血管外肺水（EVLW）的變化以及對(duì)肺組織及肺泡Ⅱ型細(xì)胞AQP-4的表達(dá)影響，從而分析特布他林藥物在急性肺損傷時(shí)如何通過(guò)影響肺水腫形成和上皮細(xì)胞來(lái)清除液體量變

2、化，進(jìn)而影響肺水腫的形成，為研究刺激β2受體cAMP途徑對(duì)水通道蛋白的影響和可能存在的機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.建立油酸肺損傷大鼠模型
　　選用2月齡二級(jí)雄性SD（Sprague Dawley）大鼠60只，實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，體重220±20克。按照序號(hào)完全隨機(jī)分為正常對(duì)照組、油酸制ALI肺損傷模型組，特布他林氣道治療組。每組各20只大鼠。三組大鼠均行氣管插管，模型組和特布他林組經(jīng)腹腔靜脈注入油酸0.

3、1ml/kg后，對(duì)照組注入等量生理鹽水。15分鐘后特布他林組氣管插管內(nèi)滴入特布他林2.5mg/kg，余各組滴入等量的生理鹽水。30分鐘后抽腹主動(dòng)脈動(dòng)脈血0.3ml血?dú)夥治雠袛喾螕p傷的程度。
　　2．致傷組大鼠肺組織損傷評(píng)價(jià)
　　腹腔靜脈注射油酸0.1ml/kg，30分鐘后抽血?dú)夥治?；治療?0分鐘腹主動(dòng)脈放血活殺。通過(guò)HE病理染色采用Smith評(píng)分法對(duì)肺水腫、肺泡及間質(zhì)炎癥、肺泡及間質(zhì)出血、肺不張和透明膜形成五項(xiàng)分別進(jìn)行0～

4、4分標(biāo)準(zhǔn)半定量分析：0級(jí)為無(wú)該項(xiàng)病理改變;1級(jí)為病理變化輕且很局限;2級(jí)為病理變化中等且局限;3級(jí)為病變中等但廣泛或局部很顯著;4級(jí)為非常顯著的廣泛性病理改變，求出各動(dòng)物肺的各項(xiàng)病理改變程度的平均程度,作為肺損傷分?jǐn)?shù)。動(dòng)脈血?dú)夥治雠袛啻笫蠓螕p傷模型是否成功建立。
　　3.大鼠ATⅡ細(xì)胞的分離、純化和鑒定
　　模型組、特布他林組及正常對(duì)照組的大鼠，取其肺組織，做好標(biāo)記，分別采用改良的胰酶消化法分離肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，用大鼠IgG

5、免疫粘附法純化細(xì)胞,臺(tái)盼蘭測(cè)細(xì)胞活力,改良的鞣酸染色法和透射電鏡鑒定細(xì)胞純度。
　　4.AQP-4大鼠肺泡組織及肺泡II型上皮細(xì)胞m-RNA表達(dá)的測(cè)定
　　免疫組織化學(xué)試劑盒進(jìn)行肺組織AQP-4免疫組化染色；Trizol提取肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞總RNA，紫外線分光光度儀OD260檢測(cè)其含量。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)AQP-4mRNA的表達(dá)。采用Strom860圖像分析系統(tǒng)行密度掃描,計(jì)算AQP4產(chǎn)物與β-acti

6、n產(chǎn)物吸光度積分的比例，作為AQP4mRNA表達(dá)水平。
　　5.血管外肺水（EVLW）的測(cè)定
　　重力法測(cè)定EVLW。放血活殺切取完整肺組織,去除支氣管,通過(guò)檢測(cè)分布于肺血管外的液體，主要為細(xì)胞內(nèi)液、肺泡內(nèi)液和肺間質(zhì)液變化反映肺水腫的程度。根據(jù)公式計(jì)算EVLW含量。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠造模后的評(píng)價(jià)
　　油酸注入后大鼠均在30s-3min內(nèi)出現(xiàn)明顯呼吸加快,淺促,口唇皮膚以及四肢發(fā)紺,氣管插管內(nèi)分泌物明

7、顯增多的臨床表現(xiàn)。血?dú)夥治鯬aCO2明顯上升，PO2下降，PaO2/FiO2值符合ALI的診斷標(biāo)準(zhǔn)。HE染色病理示肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)有小量出血,可見(jiàn)炎性細(xì)胞增多；肺泡隔增寬,肺間質(zhì)滲液明顯。
　　2.大鼠ATⅡ細(xì)胞的分離純化方法的評(píng)價(jià)
　　經(jīng)臺(tái)盼蘭染色對(duì)照組細(xì)胞活力84.3±3.21％，油酸組83.7±2.96％(圖10-11)，電鏡下見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則,呈圓形或立方形,表面有很多長(zhǎng)短不一的微絨毛,核圓形,胞質(zhì)著色淺，見(jiàn)特征性的嗜

8、鋨性板層小體(圖12)。ALI組電鏡下見(jiàn)細(xì)胞變性，細(xì)胞形態(tài)相對(duì)不規(guī)則,表面的微絨毛明顯減少,胞核變形,染色質(zhì)邊集,線粒體腫脹，胞漿內(nèi)各種細(xì)胞器明顯減少,板層小體排空顯著增多而致空泡化。
　　3.AQP4肺泡組織免疫組化染色及肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的表達(dá)
　　正常組AQP4呈弱陽(yáng)性染色,細(xì)胞偶被染成淡黃色(圖),主要分布肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則的細(xì)胞上，在ALI組AQP4呈陽(yáng)性染色，棕黃陽(yáng)性顆粒增多、染色強(qiáng)度變大。肺泡Ⅱ型細(xì)胞提取RN

9、A經(jīng)過(guò)RT-PCR擴(kuò)增后，ALI組合成明顯增加。
　　4.特布他林治療后血?dú)夥治?、病理及血管外肺水（EVLW）含量變化
　　特布他林組血?dú)夥治鑫催_(dá)到ALI診斷的標(biāo)準(zhǔn)，PO2增高；病理Smith評(píng)分較模型組明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；EVLW明顯小于模型組，明顯提高肺泡上皮液體清除。
　　5.特布他林對(duì)肺泡及肺泡II型上皮細(xì)胞AQP-4影響
　　特布他林組AQP4免疫組化呈強(qiáng)陽(yáng)性表現(xiàn)，主要分布肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則的

10、細(xì)胞上（圖29、30）。肺泡II型上皮細(xì)胞擴(kuò)增與對(duì)照組有顯著性差異，吸光度積分較模型組增加，但二者未有顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　模型組血?dú)夥治?，肺部病理改變，上皮?xì)胞的超微結(jié)構(gòu)及EVLW嚴(yán)重程度顯著高于對(duì)照組，符合肺損傷及急性呼吸窘迫綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明腹腔靜脈注射油酸建立大鼠ALI急性模型是一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單而成功率高的方法。
　　采用改良的胰酶消化法可以成功分離正常和油酸ALI大鼠的ATⅡ細(xì)胞，用大鼠IgG包被培養(yǎng)

11、皿純化細(xì)胞、鞣酸染色法鑒定細(xì)胞純度簡(jiǎn)單可行，而透射電鏡是鑒定細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)。顯微鏡下肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的數(shù)量較對(duì)照組無(wú)明顯減少，但電鏡下細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)如板層小體排空，線粒體損傷表現(xiàn)。
　　通過(guò)免疫組化證明AQP4存在于大鼠肺泡上皮，尤其II型細(xì)胞膜。RT-PCR顯示模型組ATⅡ細(xì)胞受損后，AQP4表達(dá)增高，說(shuō)明其仍具有上調(diào)水通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能。氣道內(nèi)特布他林給藥，從肺臟大體、血?dú)夥治?、病理、肺泡II型上皮細(xì)胞電鏡下形態(tài)等結(jié)果達(dá)不到肺損傷