特布他林短時間作用促進(jìn)油酸急性肺損傷大鼠肺泡液清除的機制與αENaC的相關(guān)性.pdf

1、急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合癥（Acute Lung Injury/Acute Restpiratory Distress Syndrome，ALI/ARDS）是在嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷及燒傷等非心源性疾病過程中，肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭。流行病學(xué)調(diào)查顯示，ALI/ARDS是臨床常見危重癥。根據(jù)1994年歐美聯(lián)席會議提出的ALI/ARDS診斷標(biāo)準(zhǔn)，ALI發(fā)病率為每年

2、18/10萬，ARDS為每年13～23/10萬。2005年的研究顯示ALI/ARDS發(fā)病率分別在每年79/10萬和59/10萬提示ALI/ARDS發(fā)病率顯著增高，明顯增加了社會和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，這甚至可與胸部腫瘤、AIDS、哮喘或心肌梗死等相提并論。雖然不同研究對ARDS病死率的報道差異較大，總體來說，目前ARDS的病死率仍較高。對1967年～1994年國際正式發(fā)表的ARDS臨床研究進(jìn)行薈萃分析，3264例ARDS患者的病死率在50%左右。2

3、001年3月至2002年3月上海市15家成人ICU中ARDS病死率也高達(dá)68.5%。 ALI/ARDS的基本病理生理改變是多種炎癥細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞）參與的肺臟局部炎癥反應(yīng)和（或）系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)失控所致的肺泡毛細(xì)血管膜損傷、通透性增加所致的富含蛋白的非心源性肺水腫。由于肺水腫肺水含量增加，肺泡水腫導(dǎo)致肺泡表面活性物質(zhì)層破壞，降低了肺的順應(yīng)性；肺泡水腫增加彌散距離，減少散面積及其后形成的肺泡透明膜致彌散障礙；肺

4、血管痙攣和肺微小血栓形成加重了通氣/血流比例失調(diào)，產(chǎn)生嚴(yán)重的低氧血癥。嚴(yán)重者，因呼吸機疲勞，通氣減少，致Ⅱ型呼吸衰竭。肺血管痙攣和肺微小血栓形成可引發(fā)肺動脈高壓。肺水腫在ALI/ARDS的病理生理中起著重要作用。 肺泡內(nèi)液體的主動吸收機制發(fā)現(xiàn)以前僅以Starling機制來解釋，即由于肺泡內(nèi)外存在流體靜力壓和滲透壓差異而導(dǎo)致水自肺泡吸收。自Matthay[3]等發(fā)現(xiàn)了肺泡內(nèi)液體的主動轉(zhuǎn)運機制后，為更好地治療肺水腫提供新的可能方法。

5、目前認(rèn)為肺水腫的主動重吸收為：Na+肺泡上皮細(xì)胞（包括肺泡I型上皮細(xì)胞和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞）頂膜的上皮鈉離子通道（ENaC）重吸收入細(xì)胞質(zhì)，再經(jīng)其基底膜側(cè)的Na+，K+-ATPase泵入肺間質(zhì)，Cl-通過肺泡上皮細(xì)胞CFTR，K+通過K+通道跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運，從而形成跨肺泡上皮的滲透壓差，使肺泡內(nèi)的水通過單純擴散或肺泡上皮膜的水通道進(jìn)入肺間質(zhì)。其中ENaC和Na+，K+-ATPase是兩個重要的環(huán)節(jié)和調(diào)節(jié)位點。 已發(fā)現(xiàn)多種調(diào)節(jié)肺泡液體主

6、動轉(zhuǎn)運的機制：CAMP介導(dǎo)的信號通路，多巴胺能通路，腺苷通路，激素通路，生長因子通路，絲氨酸蛋白酶通路等，其中CAMP介導(dǎo)的信號通路中的β2腎上腺能受體（β2AR）激動劑研究的最多并已進(jìn)入不少臨床試驗中。β2AR分布于肺的氣道平滑肌和肺泡上皮，分布密度隨氣道級數(shù)增加而增加，90%以上分布于肺泡上皮。目前認(rèn)為β2AR激動劑短時間通過β2AR激動劑-β2AR-GPCR-CAMP-PKA-細(xì)胞骨架蛋白，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的ENaC轉(zhuǎn)運至細(xì)胞膜上增加肺

7、泡上皮細(xì)胞膜ENaC數(shù)量；直接激活βENaC、γENaC；長時間作用增加αENaCmRNA促進(jìn)αENaC的表達(dá)，增加ENaC數(shù)量，促進(jìn)Na+的跨肺泡上皮轉(zhuǎn)運促進(jìn)肺泡液體的重吸收。 ENaC由三個蛋白質(zhì)亞基（αENaC、βENaC、γENaC）組成。分布于從鼻至肺泡的呼吸道上皮細(xì)胞膜。三個亞基以不同的方式組合形成了具有不同生物學(xué)特點和不同調(diào)節(jié)方式的鈉離子通道。不同鈉離子通道都包涵有αENaC，αENaC基因缺失的小鼠，很快死于肺

8、內(nèi)過多液而致的呼吸窘迫，γENaC基因缺失小鼠肺泡內(nèi)液清除速度減慢，未死于呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥，βENaC、γENaC基因缺失小鼠患有假性醛固酮減少癥，因失鈉和高鉀血癥而死亡。由此可見αENaC對肺泡液體重吸收很重要。 為此我們產(chǎn)生了β2AR激動劑是否通過增加αENaC的基因表達(dá)增加肺泡上皮細(xì)胞ENaC的數(shù)量促進(jìn)肺泡液體的重吸收設(shè)想，為此我們以αENaC為研究對象，選擇經(jīng)典的油酸ALI大鼠模型，以肺組織的肺水含量為指標(biāo)觀察特布他林這一

9、臨床中應(yīng)用多年的β2AR激動劑治療早期（1小時）ALI大鼠肺水腫的效果，檢測正常組大鼠，ALI/ARDS狀態(tài)組大鼠和β2AR激動劑組大鼠遠(yuǎn)端肺組織αENaCmRNA和αENaC蛋白表達(dá)，研究特布他林短時間作用增強油酸急性肺損傷大鼠肺泡液清除的機制與αENaC的相關(guān)性，為探索β2AR激動劑治療ALI的機制，為ALI的治療選擇可行、有效方法提供參考。 材料和方法: 1，實驗分組：按隨機數(shù)字法將24只200-220g的SPF級

10、雄性SD大鼠（南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供）分成正常組，ALI組和特布他林治療組共3組，n=8。 2，油酸ALI大鼠模型的復(fù)制：經(jīng)腹腔動脈抽血測血氣分析后再，注射高純度油酸0.08ml/kg，可觀察大鼠呼吸急促、顏面部皮膚粘膜發(fā)紺，1h后再抽腹腔動脈血，測血氣分析，并放血活殺，取材HE染色，根據(jù)PaO2氧合指數(shù)，HE染色結(jié)果判斷模型是否復(fù)制成功。 3，肺水腫吸收效果的測定：特布他林治療組經(jīng)氣管插管滴入硫酸酸特布他林氣霧劑

11、4×10.4mol/L1ml/kg，放血活殺后，取相同部位肺組織測定濕重，再在80℃烤箱內(nèi)放置72hs，再稱肺組織干重，肺水含量=肺濕重-肺干重/肺濕重×100%。 4，遠(yuǎn)端肺組織總α-ENaC mRNA表達(dá)測定：按Trizol（invitrogen TRIZOL（）Reagent）說明書提肺組織總RNA，選OD260/OD280比值在1.7～1.9的，再跑1%瓊脂糖電泳，得到明亮的28S、18S和暗淡的5S三條帶后，作合格標(biāo)準(zhǔn)

12、，選來自合格總RNA的RT反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)qRT-PCR反應(yīng)。采用△△Ct相對定量法定量分析各組間α-ENaCmRNA表達(dá)差異。 5，遠(yuǎn)端肺組織總α-ENaC蛋白表達(dá)測定：用RIPA強裂解液提取遠(yuǎn)端肺組織總蛋白，以β-actin為內(nèi)參western blot測定各組大鼠遠(yuǎn)端肺組織α-ENaC蛋白相對表達(dá)量。 結(jié)果: 1、ALI大鼠模型復(fù)制： 1.1：各組大鼠臨床表現(xiàn)：正常組大鼠呼吸無變化（呼吸頻率（R）：6

13、0～90次/分），無氣管插分泌物，唇鼻部皮膚仍為粉紅色；ALI組大鼠在下腔靜脈注射油酸后，很快（2min）內(nèi)出現(xiàn)持續(xù)呼吸急促（R：130～200次/分），多數(shù)在30min后有嘆氣樣呼吸，胸腹予盾運動，氣管插管內(nèi)泡沫狀紅色分泌物，大鼠唇鼻部皮膚發(fā)紺。 1.2：ALI組油酸注射前及油酸注射后1h的PaO2為：12.37±0.14、6.73±0.10；氧合指數(shù)為：441.87±5.18、240.38±3.52兩指標(biāo)兩樣配對t檢驗結(jié)果P

14、值為別0.000和0.000，都小于0.05。 1.3：肺組織病理學(xué)：大體觀：正常組肺呈粉紅色，肺形態(tài)正常，肺緣銳利；ALI組肺深紅近紫色，腫脹，發(fā)亮，以雙下肺為重，氣道分泌物多；HE染色：正常組大鼠肺組織切片可見呼吸性支氣管，肺泡管，肺泡等肺組形態(tài)正常清晰，肺泡腔不腫大，內(nèi)無紅染，肺泡壁、間質(zhì)薄。ALI組的肺泡等組織形態(tài)欠清晰，肺泡腔擴大，內(nèi)有紅染（蛋白質(zhì)性肺水腫），正在形成透明膜；肺泡壁及間質(zhì)明顯增寬、充血，粒細(xì)胞顯著增多、

15、局灶性肺不張、壞死。 2、特布他林促進(jìn)ALI大鼠肺泡液體重吸收效果的觀察：ALI組大鼠和特布他林治療組大鼠的PaO2：6.73±0.10、9.58±0.12；氧合指數(shù)：240.38±3.52、342.00±4.28；肺水含量：0.855±0.001、0.828±0.002經(jīng)兩樣本t檢驗，P值分別為：0.000、0.000、0.000都小于0.05。 HE染色：ALI組的肺組織形態(tài)欠清晰，肺泡腔擴大，內(nèi)有紅染（蛋白質(zhì)性肺

16、水腫），正在形成透明膜；肺泡壁、間質(zhì)明顯增寬，充血，粒細(xì)胞顯著增多，局灶性肺不張。特布他林治療組的肺組織形態(tài)尚可，間質(zhì)增寬，充血，但腔內(nèi)大都清晰無紅染，浸潤粒細(xì)胞較ALI組的明顯減少。 3、各組大鼠遠(yuǎn)端肺組織α-ENaC mRNA的表達(dá)差異：正常組、ALI組和特布他林治療組3組大鼠遠(yuǎn)端肺組織αENaC mRNA的相對表達(dá)量為別0.97±0.23、1.06±0.13和0.90±0.19，one-way ANOVA方差分析3者的差異

17、：P=0.825>0.1；各組大鼠遠(yuǎn)端肺組織α-ENaC蛋白的表達(dá)差異：3組αENaC蛋白相對表達(dá)量為0.217±0.003、0.213±0.002和0.217±0.002，P=0.344>0.1。 結(jié)論: 1、靜脈注射0.08ml/kg高純度油酸制備ALI大鼠模型成功； 2、β2AR激動劑特布他林能促進(jìn)早期ALI大鼠的肺水腫重吸收； 3、β2mR激動劑特布他林能促進(jìn)早期ALI大鼠的肺水腫重吸收不是通過增