丹參酮ⅡA通過激活PXR對H2O2致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護作用.pdf

1、目的：孕烷X受體(pregnane X receptor, PXR)作為核受體(nuclear receptor, NR)超家族成員之一，廣泛分布在肝臟、腸、腎臟中，參與體內(nèi)眾多藥物代謝酶及轉(zhuǎn)運體的調(diào)控,在機體內(nèi)內(nèi)源性和外源性物質(zhì)和藥物的吸收、分布、代謝及排泄等過程中扮演重要角色。前期實驗室構(gòu)建了基于分泌型Gaussia熒光素酶報告基因PXR-CYP3A4通路的穩(wěn)定工程細(xì)胞株并成功用于PXR激活效應(yīng)的快速篩選，發(fā)現(xiàn)丹參中主要有效脂溶性成

2、分丹參酮IIA（Tanshinone IIA, Tan IIA）具有明顯的PXR激活效應(yīng)，同時Tan IIA亦被證實具有明顯的心血管保護效應(yīng)。近來文獻報道PXR除了在肝臟表達(dá)外，在心血管系統(tǒng)中也有大量表達(dá)，那么Tan IIA的潛在藥理效應(yīng)及其心血管保護作用是否與其激活PXR有關(guān)。因此，本課題主要是基于PXR研究Tan IIA血管保護的效應(yīng)機制。依據(jù)PXR效應(yīng)的篩選結(jié)果，首先通過人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein

3、endothelial, HUVECs)細(xì)胞為載體，進一步確證Tan IIA對PXR表達(dá)以及活性的影響，利用過氧化氫（hydrogen peroxide, H2O2）致血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的模型，檢測PXR在Tan IIA介導(dǎo)的心血管保護機制中發(fā)揮的作用，為全面理解Tan IIA的心血管保護的作用及其藥理活性機制提供新的可能機制，為Tan IIA及其類似藥物的研究開發(fā)及臨床安全用藥提供實驗依據(jù)。
　　方法：（1）為了篩選到最佳藥物

4、濃度，分別將5~200μM Tan IIA作用于HUVECs細(xì)胞24 h：50~800μM H2O2作用HUVECs細(xì)胞3h，用CCK-8檢測細(xì)胞活力。（2）5~200μM Tan IIA預(yù)處理HUVECs細(xì)胞24h，再給與400μM H2O2處理3 h后，并分別用qRT-PCR及Western-blot檢測PXR的mRNA及蛋白表達(dá)。（3）細(xì)胞處理完提取總RNA，用qRT-PCR檢測PXR調(diào)控的靶基因CYP3A4，以及MDR1，GST

5、，GSTM1的表達(dá)。（4）通過siRNA技術(shù)敲低HUVECs細(xì)胞內(nèi)PXR表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測 PXR正常表達(dá)和敲低兩種條件下H2O2致細(xì)胞損傷及Tan IIA逆轉(zhuǎn)效應(yīng)在兩種條件下的差異。（5）ELISA試劑盒檢測H2O2誘導(dǎo)對HUVECs細(xì)胞凋亡信號分子Caspase3/7、8、9的影響，熒光顯微鏡觀察Hoechst33342染色，TUNEL凋亡試劑盒檢測DNA的變化，高內(nèi)涵細(xì)胞成像技術(shù)檢測凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-induci

6、ng factor,AIF）的核內(nèi)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。
　　結(jié)果：（1）低濃度Tan IIA對內(nèi)皮細(xì)胞活力沒有明顯的影響，高濃度時有明顯的細(xì)胞毒性。根據(jù)細(xì)胞活力實驗選出最佳藥物濃度5~20μM預(yù)處理HUVECs細(xì)胞24 h后在給與400μM H2O2處理3h。（2）5、10、20μM Tan IIA單獨處理細(xì)胞24 h，可以濃度依賴性的誘導(dǎo) HUVECs細(xì)胞 PXR mRNA和蛋白的表達(dá)，同時上調(diào)CYP3A4、MDR1、GST、GSTM1和

7、GPx的表達(dá)。（3）Tan IIA可以抑制H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞ROS，MMP和凋亡的升高，在PXR敲低條件下，Tan IIA的保護作用明顯減弱。（4）Tan IIA可以明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞凋亡及其相關(guān)凋亡分子的表達(dá)，減少其導(dǎo)致的HUVECs細(xì)胞凋亡。
　　總結(jié)：Tan IIA通過激活PXR受體并進一步上調(diào)其調(diào)控的靶基因CYP3A、GST、GSTM1和GPx的表達(dá)，實現(xiàn)對H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞的氧