乙肝相關(guān)性肝病肝臟內(nèi)干細(xì)胞樣細(xì)胞的特性和定向分化.pdf

1、前言： 目前全球有3.5億乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性攜帶者，每年約1百萬死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化、原發(fā)性肝癌。中國屬HBV感染高流行國家，約有1.2億慢性HBV攜帶者和3000萬慢性乙型肝炎患者，這些慢性乙型肝炎患者很容易發(fā)展成肝硬化、肝癌。因此，慢性乙型肝炎是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，但是HBV的精確致病機(jī)制尚未完全闡明。盡管外科技術(shù)和各種輔助治療手段的完善，但是肝臟的功能衰竭和

2、肝癌手術(shù)切除后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是乙肝相關(guān)性肝病的主要死亡原因。因此，乙型肝炎病毒慢性感染導(dǎo)致的肝臟纖維化、肝硬化甚至肝細(xì)胞肝癌仍然是基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。盡管在肝臟病毒感染后所致的肝臟纖維化在一定的條件下可以實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，但是目前的研究結(jié)果僅僅局限于動物模型中，尤其是在晚期肝硬化形成后，肝臟的病理改變已無法逆轉(zhuǎn)。 眾所周知，人體多種組織器官中存在干細(xì)胞，這些細(xì)胞在器官損傷時(shí)是組織再生和修復(fù)。研究認(rèn)為，組織器官中的干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞有著

3、密切的關(guān)系且具有某些共同特征。最近的研究表明，組織器官中的成體干細(xì)胞可能是組織細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的靶細(xì)胞。在發(fā)生組織損傷的器官中，慢性感染和組織再生可以導(dǎo)致組織正常的干細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化而成為癌細(xì)胞，而這些發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的干細(xì)胞就被稱為腫瘤干細(xì)胞。 乙型肝炎病毒的常常導(dǎo)致肝臟的慢性感染，漫長的病程有往往導(dǎo)致肝臟硬化和肝癌。干細(xì)胞樣細(xì)胞在肝臟的慢性感染時(shí)發(fā)生富集且其數(shù)量與肝臟病變的嚴(yán)重程度呈顯著的正相關(guān)，而這些干細(xì)胞直接參與了動物模型中

4、肝癌的發(fā)生。因此肝臟干細(xì)胞可能在人類肝癌的形成中扮演了重要的角色，鑒定這些細(xì)胞將有助于我們對人體肝癌發(fā)生的理解和認(rèn)識。 新近的研究表明，在體外特定的誘導(dǎo)條件下，具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在特定的誘導(dǎo)條件下可以通過間質(zhì)-上皮(MET)途徑分化為成熟肝細(xì)胞。同時(shí)有研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞和纖維母細(xì)胞之間有著密切的關(guān)系，它們可能代表相同細(xì)胞的不同功能階段。這些纖維母細(xì)胞不但表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記，而且在特定的誘導(dǎo)條件

5、下，這些細(xì)胞表現(xiàn)出多向分化潛能。因此，在以往很多研究中，間充質(zhì)干細(xì)胞和纖維母細(xì)胞的概念經(jīng)常交互使用。這些關(guān)于纖維母細(xì)胞的研究提示我們肝硬化肝臟內(nèi)的纖維母細(xì)胞同樣也可能具有干細(xì)胞的細(xì)胞特性。 在本研究中，我們首先用免疫組化的方法觀察了在肝硬化、肝癌和癌旁組織中干細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)，將來源于乙肝肝硬化和肝癌癌旁組織中的細(xì)胞種植入BN)(小鼠，以探討這些細(xì)胞的致瘤特性。在體外實(shí)驗(yàn)中，我們進(jìn)一步檢測了不同來源的組織干細(xì)胞樣細(xì)胞的增殖、自

6、我更新和克隆能力。之后，在成功分離出肝硬化和肝癌組織中纖維母細(xì)胞后，用多種方法觀察了這些纖維母細(xì)胞的干細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)情況和分化潛能。我們認(rèn)為，在體外的誘導(dǎo)條件下，肝硬化和肝癌組織內(nèi)的纖維母細(xì)胞可以增殖和分化為具有分泌功能的成熟肝細(xì)胞的能力。 材料和方法： 我們收集了我院20例手術(shù)切除的肝癌組織、相應(yīng)的癌旁組織和10肝硬化組織標(biāo)本。從以上的三種組織中我們分別挑選了5例組織進(jìn)行和免疫缺陷小鼠的組織塊種植和分離培養(yǎng)后的纖維

7、母細(xì)胞的細(xì)胞種植。 免疫組織化學(xué)染色(IHC)ABC法檢測三種組織樣本中c-kit、CD133、CD90、CD34、CKl8和CK-19等。以PSB代替一抗作為陰性對照。分離不同組織樣本中的纖維母細(xì)胞，分別以細(xì)胞免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光技術(shù)和蛋白免疫印跡技術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法，觀察纖維母細(xì)胞CD73、CD44、CD34、CIM5、CD90、c-kit和CD133等標(biāo)記進(jìn)行了細(xì)胞免疫表型的分析，同時(shí)應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光的方法觀察細(xì)胞中波

8、形蛋白、結(jié)蛋白、纖維連接蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、纖維母細(xì)胞特異抗原、CK-18、CK-19和白蛋白等的表達(dá)情況。 在不同的體外培養(yǎng)的條件下，我們觀察了來源于三種不同組織中的細(xì)胞的體外增殖、自我更新和克隆形成能力；同時(shí)，我們對來源于肝硬化肝臟和肝癌組織內(nèi)的纖維母細(xì)胞細(xì)胞在不同的培養(yǎng)階段的細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)進(jìn)行了觀察。 為了評估不同組織和組織細(xì)胞的致瘤特性，肝硬化和肝癌癌旁組織各5例樣本在MEM培養(yǎng)基

9、中被剪成1-2 mm3大小的組織塊，然后用已經(jīng)配制好的PBS液洗滌2次，各樣本稱取50毫克，以18號穿刺針無菌條件下接種于免疫缺陷小鼠左側(cè)腋窩皮下，同時(shí)把4例來源于肝癌的纖維母細(xì)胞按1X10E6／只進(jìn)行了細(xì)胞皮下注射。記錄成瘤時(shí)間并計(jì)算成瘤率，觀察移植瘤大小、形態(tài)、質(zhì)地及活動度。五個月后，拉頸處死所有小鼠，切取腫瘤組織標(biāo)本并分別行病理學(xué)檢查(10％甲醛固定后，HE染色)及免疫組織化學(xué)檢查。 在成功分離不同組織樣本中的纖維母細(xì)胞的

10、基礎(chǔ)上，采用體外誘導(dǎo)分化的方法，對不同來源的纖維母細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞的分化特性進(jìn)行了研究。 結(jié)果： 對肝硬化、肝癌和癌旁組織中的干細(xì)胞表面標(biāo)記的免疫組化分析結(jié)果顯示，非癌組織中的干細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)高于癌組織。不同組織內(nèi)呈現(xiàn)不同的干細(xì)胞表達(dá)模式。CD34和CD90陽性表達(dá)部位多集中在增殖的膽管上，它們在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上往往代表肝臟祖細(xì)胞；CD133和c-kit陽性細(xì)胞則多分布在肝或肝癌實(shí)質(zhì)中，它們在形態(tài)和空間位置上類似過渡性的中間

11、肝細(xì)胞。CK-18和CK-19陽性的細(xì)胞在多數(shù)的組織樣本中都有表達(dá)，部分CK-18和CK-19陽性的細(xì)胞散在分布于硬化肝臟的實(shí)質(zhì)組織中，它們在細(xì)胞形態(tài)上表現(xiàn)出肝細(xì)胞的圓核和多邊形細(xì)胞膜，這些細(xì)胞代表過渡性肝細(xì)胞。 體外實(shí)驗(yàn)也表明，來源于乙肝相關(guān)性肝硬化和肝癌癌旁組織內(nèi)的細(xì)胞具有高度的增殖、自我更新和克隆形成能力。 肝硬化肝臟和肝癌組織內(nèi)的少數(shù)纖維母細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記CD73和CD44而無骨髓造血干細(xì)胞的細(xì)

12、胞表面標(biāo)記CD34和CIM5的表達(dá)；少部分的纖維母細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記CD90、c-kit和CD133。除了極少數(shù)的細(xì)胞表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白外，幾乎所有細(xì)胞表達(dá)波形蛋白、結(jié)蛋白、纖維連接蛋白、纖維母細(xì)胞特異抗原。此外，極少的細(xì)胞表達(dá)CK-18或CK-19但未發(fā)現(xiàn)白蛋白陽性細(xì)胞。 在體外特異性的誘導(dǎo)條件下，肝硬化肝臟內(nèi)的纖維母細(xì)胞以一種時(shí)間依賴的方式逐漸分化為肝細(xì)胞所特有的多邊形細(xì)胞形態(tài)，而在此過程中伴隨著不同肝系細(xì)胞蛋白標(biāo)記

13、的表達(dá)。纖維母細(xì)胞胞體由梭型或長梭形形態(tài)，培養(yǎng)2周后，胞體增大、變寬，形狀不規(guī)則。培養(yǎng)周后，細(xì)胞進(jìn)一步縮短，變寬，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)肝細(xì)胞典型的多邊形。 對肝硬化、肝癌和癌旁組織在BNX小鼠體內(nèi)的成瘤性研究發(fā)現(xiàn)，種植了癌旁組織的兩組共三只小鼠長出了腫塊，肉眼觀腫塊直徑大小都約1cm，組織HE染色表明腫塊中心有大片的壞死區(qū)域，鏡下觀，組織實(shí)質(zhì)由大量的實(shí)質(zhì)細(xì)胞團(tuán)塊組成，且這些細(xì)胞具有高核／漿比，細(xì)胞的排列紊亂，失去正常

14、的組織結(jié)構(gòu)和極性。同時(shí)，組織免疫組化染色發(fā)現(xiàn)有CD133和c-kit陽性表達(dá)，而這些陽性細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上都表現(xiàn)出卵圓細(xì)胞的特征。來源于肝癌、經(jīng)過長期體外培養(yǎng)的纖維母細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)有腫塊形成。 結(jié)論： 在乙型肝炎引起的肝硬化、肝癌和癌旁組織中有多種干細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)，這些干細(xì)胞表明標(biāo)記呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式并代表不同的細(xì)胞類型。來源于乙肝肝硬化和肝癌癌旁組織內(nèi)的細(xì)胞具有高度的增殖、自我更新和克隆形成能力。這些組織內(nèi)干細(xì)胞

15、樣細(xì)胞具有高度的致瘤特性，并可能存在著肝癌腫瘤干細(xì)胞。這些研究結(jié)果進(jìn)一步完善了肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移機(jī)制，為乙型肝炎引起的肝臟疾病的防治提供了新的思路。 乙型肝炎慢性感染引起的肝硬化和肝細(xì)胞肝癌組織內(nèi)的纖維母細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞特性，在體外條件下，可以分化為具有特異性功能的成熟肝細(xì)胞。因此，這些纖維母細(xì)胞可以作為組織工程的肝臟肝細(xì)胞的來源。同時(shí)，肝硬化肝臟內(nèi)的纖維母細(xì)胞通過間質(zhì)一上皮轉(zhuǎn)變(MET)分化為成熟肝細(xì)胞也提示，傳統(tǒng)意義