佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔巨噬細胞異常功能變化及木瓜苷和芍藥苷的作用.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、異質(zhì)性、系統(tǒng)性的自身免疫性疾病。其主要特征是關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)的進行性破壞，并伴有免疫功能的紊亂。巨噬細胞在炎癥反應(yīng)過程起著十分重要的作用。在局部或全身炎癥反應(yīng)過程中，巨噬細胞活化，其功能發(fā)生改變，同時產(chǎn)生許多炎癥介質(zhì)，其中包括 TNF-a、IL-1、PGE<,2>、IL-6等。鳥苷酸結(jié)合蛋白(Guanine nucleotide-binding proteins，G

2、-protein)，簡稱G蛋白，其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在炎癥免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、磷脂、光刺激、嗅覺及味覺特異性配基和絲裂原均可通過跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors，GPCRs)引發(fā)G蛋白活化及其下游信號傳遞。佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)模型大鼠腹腔巨噬細胞功能的異常改變可能與G蛋白-cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常改變有關(guān)。本研究在建立大鼠

3、AA模型的基礎(chǔ)上，研究從安徽道地藥材木瓜中制取的有效部位木瓜苷(glucosides of chaenomeles speciosa,GCS)和白芍總苷的主要成分芍藥苷(paeoniflorin，PF)對AA大鼠腹腔巨噬細胞異常功能變化及其部分作用機制，為進一步篩選高選擇性的RA有效治療藥物、開發(fā)和利用中藥及天然藥物資源提供理論依據(jù)。 目的：研究GCS和PF對AA大鼠繼發(fā)性炎癥反應(yīng)的治療作用；以腹腔巨噬細胞為突破口，闡明大鼠AA

4、狀態(tài)下腹腔巨噬細胞功能異常變化并明確GCS和PF在這方面的作用。 方法：大鼠足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑(Freund’s completed Adjuvant，F(xiàn)CA)，誘發(fā)大鼠AA模型，以GCS30、60、120mg·kg<'-1>(ig，d17～d24)治療給藥，PF25、50、100 mg·kg<'-1>(ig，d17～d24)、雷公藤多苷(glucosides of tripterygium wifordii，GTW)作陽

5、性對照40mg·kg<'->(ig，d17～d24)。足容積法測量大鼠繼發(fā)側(cè)足爪腫脹度(△ml)。吞噬功能采用中性紅法測定，白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)活性的測定采用小鼠胸腺細胞增殖法，腫瘤壞死因子 a(tumor necrosis Factor alpha，TNF-a)、前列腺素 E2(prostaglandin E2，PGE<,2>)和環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate

6、，cAMP)含量的測定采用放射免疫測定法，Western blot檢測腹腔巨噬細胞中 G 蛋白偶聯(lián)受體激酶2(G protein-coupled receptorkinases，GRK2)、視紫紅質(zhì)抑制蛋白(arrestin)中的B-arrestinl、前列腺素E2受體(E-prostanoid，EP2)的表達水平。 結(jié)果： 1．GCS和PF對大鼠AA具有治療作用應(yīng)用FCA誘導(dǎo)大鼠AA模型，其繼發(fā)性反應(yīng)表現(xiàn)為以多發(fā)性關(guān)節(jié)

7、炎為特征的關(guān)節(jié)腫脹和觸痛、消瘦、活動障礙等類似RA的癥狀。AA模型組在致炎后d17、d21、d24繼發(fā)側(cè)足腫脹度與正常組比較明顯增加。GCS30、60、120mg·kg<'-1>(ig，d17～d24)和PF25、50、100 mg·kg<'-1>(ig，d17～d24)體內(nèi)給藥可不同程度明顯減輕AA大鼠的繼發(fā)性足腫脹。表明GCS和PF對大鼠AA具有治療作用。 2．改善AA大鼠腹腔巨噬細胞異常吞噬功能是治療大鼠AA的重要作用環(huán)節(jié)

8、AA 模型組腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的量明顯高于正常組。同時，GCS60，120mg·kg<'-1>(ig，d17～d24)和PF25、50、100 mg·kg<'-1>(ig，d17～d24)能明顯抑制腹腔巨噬細胞過強的吞噬功能。表明GCS和PF均可通過改善AA大鼠異常吞噬功能從而發(fā)揮其治療作用。 AA大鼠腹腔巨噬細胞中IL-1、TNF-a、PGE<,2>的生成明顯高于正常組。GCS(30mg·kg<'-1>)與AA組比較，對I

9、L-1及TNF-a的生成，沒有明顯改變；對PGE<,2>的生成有顯著性改變。GCS60，120mg·kg<'-1>可明顯抑制PMΦ中IL-1、TNF-a、PGE<,2>的生成。PF25mg·kg<'-1> 與 AA組比較，對IL-1、TNF-a及PGE<,2>的生成，均沒有顯著性差異。PF50，100mg·kg<'-1>可明顯抑制PMΦ中IL-1、TNF-a、PGE2的生成。對AA大鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生過高的IL-1、TNF-a及PGE<

10、,2>水平有抑制作用，表明GCS和PF可能通過直接作用或抑制腹腔巨噬細胞分泌炎性細胞因子，調(diào)節(jié)AA大鼠免疫功能是其發(fā)揮作用的重要途徑之一。3. GCS和PF影響AA大鼠滑膜細胞G蛋白-AC-cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路GCS60，120 mg·kg<'-1> 和PF25、50，100 mg·kg<'-1>顯著提高腹腔巨噬細胞cAMP水平。GCS和PF對腹腔巨噬細胞cAMP水平的影響提示G蛋白-AC-cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能參與其過程。

11、為了進一步探討GCS和PF影響AA大鼠腹腔巨噬細胞G蛋白水平與升高cAMP含量之間的關(guān)系，對GCS 30，60，120 mg·kg<'-1>和PF25，50，100 mg·kg<'-1>治療給藥(ig，d 17～d24)后大鼠腹腔巨噬細胞EP2、GRK2、B-arrestin1蛋白表達水平進行檢測，結(jié)果表明，AA大鼠腹腔巨噬細胞中EP2和B-arrestin1表達較正常組大鼠升高，GRK2表達較正常組均無明顯差異。而GCS(60，120

12、 mg·kg<'-1>)可不同程度地下調(diào)EP2和B-arrestin1的表達；PF(25，50，100 mg·kg<'-1>)可明顯下調(diào)B-arrestin1的表達；對EP2的表達有下調(diào)的趨勢，但不顯著。提示：G蛋白-AC-cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)了大鼠 AA 的發(fā)病過程，降低EP2受體的表達、調(diào)節(jié)GRK2/B-arrestin1的平衡、影響AA大鼠腹腔巨噬細胞PGE<,2>-EP-G蛋白-cAMP信號的正常轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是GCS和PF發(fā)揮治

13、療作用的機制之一。 結(jié)論： 1. GCS和PF對大鼠AA關(guān)節(jié)局部腫脹具有明顯的治療作用，改善其異常的吞噬功能是發(fā)揮作用的重要途徑之一。 2．GCS和PF不同程度上均可抑制AA大鼠腹腔巨噬細胞分泌IL-1、TNF-a、PGE<,2>水平。 3. GCS和PF不同程度下調(diào)AA大鼠腹腔巨噬細胞中B-arrestin1和EP2的蛋白表達，促進cAMP生成增加，影響了G蛋白-AC-cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這可能是GC