調(diào)控番紅花糖苷合成、柱頭發(fā)育基因挖掘及功能研究.pdf

1、番紅花是鳶尾科番紅花屬球莖類草本植物，具有良好的活血化瘀、涼血解毒、解郁安神的功效，現(xiàn)代多用于治療心腦血管疾病和抑郁癥。其特有的以藏紅花苦素、藏花醛、西紅花酸及其糖苷衍生物西紅花總苷為代表的類胡蘿卜素類化合物是發(fā)揮藥效的主要成分。番紅花柱頭是西紅花苷等成分合成和積累的場所，柱頭作為藥用部位其生物量較小而導(dǎo)致產(chǎn)量稀少。整合分析多重組學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)掘西紅花柱頭發(fā)育或糖苷合成相關(guān)基因，利用分子生物學(xué)手段，開展番紅花有效成分生源途徑解析，并驗(yàn)證影響

2、柱頭發(fā)育基因的生物學(xué)功能。在此基礎(chǔ)上，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)番紅花品系，能有效緩解西紅花市場的供需矛盾。
　　為了發(fā)現(xiàn)潛在的關(guān)鍵酶基因及分子調(diào)控基礎(chǔ)，本課題針對不同發(fā)育時(shí)期的番紅花柱頭同步進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析，特別監(jiān)控與西紅花苷合成途徑相關(guān)的代謝流。從轉(zhuǎn)錄組中共組裝得到269，943條Unigenes，根據(jù)差異基因的表達(dá)趨勢可將所有的差異基因分為7種表達(dá)模式，共注釋出181條可能參與西紅花苷合成的酶基因，篩選出63個(gè)可能調(diào)控西紅花苷合成

3、的轉(zhuǎn)錄因子。而代謝組分析指認(rèn)出15個(gè)西紅花苷合成途徑中的化合物，其含量變化趨勢可分為4種模式。為了深入挖掘基因和化合物間的相關(guān)性，本研究整合兩個(gè)組學(xué)數(shù)據(jù)，構(gòu)建了“轉(zhuǎn)錄因子-基因-化合物”共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，切實(shí)將候選基因的范圍縮小到32條酶基因及28條編碼轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄本。更重要的是，共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)篩分別篩選到7、4和4條目前在西紅花苷合成途徑中未被具體研究的關(guān)鍵酶基因β-GS、ADH和UGT。釀酒酵母的代謝工程研究顯示篩選的CsADH酶可催化合成

4、西紅花酸，亦證實(shí)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)篩選目標(biāo)基因方法的可靠性。
　　綜合“基因-化合物”共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析及熒光定量PCR結(jié)果，指認(rèn)AGL6b基因的表達(dá)與西紅花酸隨柱頭發(fā)育的含量變化正相關(guān)。而AGL6基因?qū)儆贛ADS-box調(diào)控因子家族，該家族在多種模式植物中都表現(xiàn)出調(diào)控花發(fā)育的功能，由此推測:番紅花AGL6b基因與西紅花苷合成途徑中的次生代謝產(chǎn)物積累有密切聯(lián)系，可能是通過調(diào)控番紅花花器官的發(fā)育，引起柱頭生物量的改變而導(dǎo)致次生代謝物含量變化。因

5、而對來自西紅花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的17條MADS-box轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，解讀核苷酸序列，及對其編碼的氨基酸序列的組成成分、理化性質(zhì)、信號肽、導(dǎo)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、親疏水性、蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu)及功能域進(jìn)行預(yù)測分析，并將番紅花和其他植物的MADS-box蛋白進(jìn)行同源比對，同時(shí)構(gòu)建了番紅花和模式植物擬南芥MADS-box蛋白家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹，其結(jié)果為今后進(jìn)一步深入研究番紅花MADS-box蛋白的生物學(xué)功能提供可靠的

6、參考依據(jù)。
　　整合共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及番紅花轉(zhuǎn)錄組，獲得5條在番紅花柱頭中特異性高表達(dá)的MADS-box基因，命名為SCR(Stigma and Crocins Regulator)。為了驗(yàn)證此類基因?qū)τ诜t花柱頭發(fā)育或糖苷合成的調(diào)控作用，對所得序列進(jìn)行克隆和分析，初步開展亞細(xì)胞定位及擬南芥過表達(dá)的實(shí)驗(yàn)。CsSCR基因編碼的氨基酸分子量在25.0kDa左右，等電點(diǎn)在9.15左右，均為堿性蛋白。同時(shí)結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)5個(gè)蛋白都含有60個(gè)氨基酸

7、組成的MADS結(jié)構(gòu)域，以及其后都接有93個(gè)氨基酸大小的K-BOX結(jié)構(gòu)域，證明5條蛋白都屬于MADS轉(zhuǎn)錄因子家族。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)5條番紅花SCR蛋白的轉(zhuǎn)錄因子特性，其定位于細(xì)胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用;而擬南芥過表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CsSCR3和CsSCR5可調(diào)控?cái)M南芥花發(fā)育，導(dǎo)致早花現(xiàn)象出現(xiàn)。
　　綜上所述，本研究整合多重組學(xué)數(shù)據(jù)，報(bào)道了多個(gè)參與西紅花苷合成途徑的候選基因，為后續(xù)開展番紅花有效成分生源途徑解析奠定了基礎(chǔ)，并提供了一個(gè)