LaeA和LaeA-like蛋白調控草酸青霉無性發(fā)育及糖苷水解酶合成的研究.pdf

1、青霉屬真菌能夠產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物，對于人類疾病治療和農業(yè)發(fā)展具有重要影響。同時，很多青霉能夠產(chǎn)生木質纖維素降解酶，并被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)，有力的推動了生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。其中，革酸青霉（Penicillium oxalicum）能夠產(chǎn)生酶系完全的木質纖維素降解酶，其高產(chǎn)突變菌株已經(jīng)應用于纖維素酶工業(yè)生產(chǎn)多年。但是，高產(chǎn)突變株伴隨著產(chǎn)孢能力嚴重下降，由此帶來了工業(yè)生產(chǎn)成本的增加。此外，研究發(fā)現(xiàn)，草酸青霉中具有28個次級代謝基因簇，具有潛在的生

2、產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的能力。因此，深入了解纖維素酶合成及孢子形成的調控機制及糖苷水解酶合成機制，對草酸青霉的工業(yè)應用具有重要意義。
　　我們主要研究內容如下:
　　1.草酸青霉LaeA調控孢子發(fā)生及次級代謝LaeA對于草酸青霉孢子合成及次級代謝具有重要的調控作用。在草酸青霉中，laeA缺失后（ΔlaeA）嚴重影響分生孢子的合成，ΔlaeA中與孢子合成相關的brlA和abaA表達量顯著下調，表明LaeA的調控位于這兩個基因上游。當在

3、ΔlaeA中過表達brlA能夠明顯上調brlA，abaA和wetA的表達量，但是仍不能恢復分生孢子的缺陷。ΔlaeAΔcreA完全阻斷孢子形成，7個與色素合成相關的基因（albA/wA，abrB/yA, arpA，aygA，arpA-like，arpB，arpB-like）和3個孢子壁蛋白基因（rodA，rodA-like和rodB）表達幾乎沉默，推測這是雙敲菌株產(chǎn)孢障礙的重要原因。同時，ΔlaeA，ΔcreA及ΔlaeAΔcreA中細

4、胞壁形成相關基因表達下調，使ΔlaeA和ΔlaeAΔcreA對于CR，SDS和CFW的耐受能力明顯下降。此外，草酸青霉中28個次級代謝基因簇中，有4個簇在ΔlaeA中表達沉默，其中2個與BrlA缺失株中沉默基因簇重合，表明LaeA參與基因簇沉默部分由BrlA介導。共調控基因簇中6個典型的連續(xù)區(qū)域位于染色體端粒區(qū)附近，表明LaeA調控的基因簇具有朝向端粒區(qū)的位置偏好性。沉默基因簇在ΔlaeAΔcreA菌株中脫阻抑，表明敲除laeA后，Cr

5、eA的缺失能夠修復基因簇的抑制作用，可能是由另一LaeA-like甲基轉移酶PDE03083介導。另外，草酸合成基因PDE_06062在三株突變株中都表達下調，革酸含量測低于野生型，ΔlaeAΔcreA更是表現(xiàn)出疊加效應，革酸合成最低。酵母雙雜交顯示，盡管LaeA與CreA并沒有直接的相互作用，但是LaeA和CreA的共調控功能對于無性孢子的正常合成及基因簇的表達是必需的。在革酸青霉中，LaeA能夠與纖維素酶/半纖維素酶基因的轉錄激活因

6、子XlnR及染色質重塑因子Swi6相互作用（未發(fā)表），推測LaeA被XlnR招募，通過組蛋白修飾及染色質重塑的功能使得染色質開放，激活孢子形成、次級代謝基因簇相關基因的轉錄。
　　2.草酸青霉LaeA-like蛋白對于纖維素酶基因表達及孢子發(fā)生調控初步研究LaeA對于木質纖維素降解酶的合成具有調控作用。氨基酸序列分析顯示，以LaeA為代表的草酸青霉第23家族成員(LaeB、LaeC、LaeD、LaeE、LaeF、LaeG、LaeH

7、、LaeI)都含有SAM結合位點，預測為蛋白甲基轉移酶。進化樹分析表明第23家族甲基轉移酶與LaeA親緣關系較近，推測它們對于纖維素酶合成及孢子發(fā)生的調控或許與LaeA具有相似的調控模式。研究發(fā)現(xiàn)，ΔlaeB在單一碳源培養(yǎng)基上，菌體生長較差，菌落褶皺多，孢子計數(shù)進一步確認ΔlaeB孢子數(shù)量較野生型略低。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，ΔlaeB菌絲數(shù)量較少，產(chǎn)孢延遲約2h。LaeB缺失菌株（ΔlaeB）纖維素酶合成顯著下調，相反，ΔlaeE、ΔlaeI濾