海參α-糖苷鍵水解酶與海參體壁自溶相關(guān)性研究.pdf

1、海參營養(yǎng)價值豐富，然而海參的自溶現(xiàn)象使海參營養(yǎng)流失嚴(yán)重，即使在熱加工過的海參在貯存、銷售中也存在體壁劣化問題，因此尋找海參體壁自溶的影響因素成為研究熱點。本文則探究海參體壁中α-糖苷鍵多糖水解酶（以果膠酶為重點研究對象）及其與海參體壁自溶的相關(guān)性。
　　首先比較了用于多糖水解酶活力測定的還原端基測定法，如DNS法、PAHBAH法和MBTH法，結(jié)果表明，三種方法測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，其靈敏度MBTH法最高，PAHBAH法次之，

2、DNS法最低。由于PAHBAH法的顯色產(chǎn)物穩(wěn)定性較差，不適合酶活力的大批量測定，而DNS法靈敏度過低，因此，選擇MBTH法用于海參體壁多糖水解酶活力的微量測定。
　　其次以仿刺參（Apostichopus japonicus）為實驗材料，利用機械勻漿、緩沖液浸提、硫酸銨鹽析、透析等分離方式從海參體壁中得到粗酶，發(fā)現(xiàn)具有果膠酶活力、淀粉酶活力、甘露聚糖酶活力，其中果膠酶活力最高。偏堿性條件浸提更易得到較高的果膠酶活力。以果膠為底物，

3、研究粗酶中果膠酶的部分酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pH7.0時，果膠酶活性最高，在pH3.0-10.0條件下保存4hr后，果膠酶活性均略有升高，表明一定離子強度對果膠酶活力具有激活作用，且該酶耐酸堿性良好;在90℃時，果膠酶活力最高;在90℃條件下保溫20min前后活力無顯著性變化，說明該果膠酶耐強熱，這對研究經(jīng)熱加工過的海參體壁在貯藏期內(nèi)的體壁劣化機理具有重要意義。
　　為了對上述所得粗酶進一步純化，通過測定粗酶液的總帶電情況，發(fā)現(xiàn)大

4、部分蛋白的等電點集中在pH4.40，因而選擇陰離子交換柱層析，結(jié)果表明，當(dāng)使用DEAE-52弱陰離子填料時，果膠酶比活較高點集中在0.1M、0.2M的低NaCl濃度交換洗脫峰中。為收集更多的果膠酶，改用Q-Fast Flow強陰離子填料，流動相pH從7.0提高至8.0，但并沒有收集到更多果膠酶，表明兩種方法均可用于分離果膠酶。電泳圖的結(jié)果比較表明，海參體壁中的果膠酶分子量可能為280-288kDa。
　　分別研究了離子峰1(0.1

5、M NaCl洗脫峰)和離子峰2（0.2M NaCl洗脫峰）的酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明，在酶解溫度為90℃和酶解pH為7.0時，離子峰1組分中果膠酶活力最高，100℃保溫20min后仍具有40％的活力，Ba2+、K+對該酶有明顯的激活作用，F(xiàn)e3+、Mg2+、Zn2+對該酶有明顯的抑制作用，Ca2+、Mn2+對該酶具有微弱的抑制作用，EDTA對可強烈抑制該酶的活性，表明該酶具備金屬酶的性質(zhì)。在酶解溫度為80℃和酶解pH為7.0時，離子峰2組分中

6、果膠酶活力最高，在100℃條件下保溫20min，活力非降反升至原來的150％，Ba2+、Fe3+、Ca2+對離子峰2中的果膠酶有明顯的激活作用，Mg2+、Mn2+、K+對該酶有明顯的抑制作用，Zn2+對該酶基本沒有抑制效果，EDTA可強烈抑制該酶的活性，表明該酶也具備金屬酶的性質(zhì)。強熱使其活力非降反升的原因有待于更深入的研究。
　　最后研究海參體壁果膠酶與海參自溶的相關(guān)性，以滅過酶的海參體壁組織為底物分別以透析粗酶液、Q-Fast