節(jié)桿菌W1苯酚水解酶基因及編碼蛋白的研究.pdf

1、本研究從某污水處理廠活性污泥中篩選到一株高效的苯酚降解菌，通過形態(tài)觀察、生理生化特性及16S rRNA序列分析，鑒定其為節(jié)桿菌Arthrobacter sp．W1，其16S rDNA序列的GenBank登陸號為EU339930。在此基礎(chǔ)上，通過分子生物學(xué)手段，對該菌株苯酚羥化酶的編碼基因以及編碼蛋白的酶學(xué)特性進(jìn)行了深入的研究。 ⑴以Arthrobacter sp．W1為研究對象，根據(jù)苯酚羥化酶的保守序列合成了一對引物，以Art

2、hrobacter sp．W1的基因組DNA為模板，通過PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出685 bp的同源序列。 ⑵根據(jù)擴(kuò)增得到的Arthrobacter sp．W1苯酚羥化酶基因保守序列，采用染色體步移的方法對其5’端及3’端的未知側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增，最終得到Arthrobacter sp．W1菌株的苯酚羥化酶基因全長序列5490 bp，其Genbank注冊號為：FJ610336。通過分析可知，Arthrobacter sp．W1菌株的苯酚

3、羥化酶全基因序列中含有6個開放閱讀框，分別為：ORF1～ORF6，經(jīng)過blast同源比對，推測其分別編碼苯酚羥化酶的6個亞基。 ⑶使用PCR的方法擴(kuò)增得到苯酚羥化酶全長基因并成功地將其構(gòu)建至pET—28a(+) Vector，轉(zhuǎn)化后得到用于苯酚羥化酶蛋白表達(dá)的工程菌pET—28a(+)—hydroxylase BL21(DE3)。在IPTG誘導(dǎo)下，該工程菌可以穩(wěn)定高效地表達(dá)苯酚羥化酶。同時對苯酚羥化酶PHO粗酶的活性進(jìn)行了探討