貝西滑刃線蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及糖苷水解酶16基因克隆.pdf

1、貝西滑刃線蟲(chóng)作為一種植物寄生線蟲(chóng)，廣泛寄生于多種植物中。據(jù)記載有35個(gè)屬。線蟲(chóng)通過(guò)分泌纖維素酶來(lái)降解植物細(xì)胞壁，以便進(jìn)入植物組織，致使植物感病。為研究線蟲(chóng)侵染相關(guān)基因及其致病過(guò)程、為基因平移假說(shuō)提供佐證，進(jìn)行了相關(guān)研究。
　　試驗(yàn)用東北林業(yè)大學(xué)森林病理標(biāo)本室保存的貝西滑刃線蟲(chóng)種群，分離擴(kuò)繁備用。Trizol提取線蟲(chóng)總RNA，純化RNA后經(jīng)過(guò)分光光度計(jì)檢驗(yàn)符合要求;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)制備采用Illumina/Solexa標(biāo)準(zhǔn)操作步驟由L

2、C公司完成，共得到46，826，350個(gè)rawreads，通過(guò)后續(xù)嚴(yán)格篩選得到36，905，372個(gè)高質(zhì)量clean reads，平均長(zhǎng)度為89.89 bp。clean reads占總raw reads的78.81％;使用軟件Trinity，應(yīng)用paired-end的拼接方法將線蟲(chóng)有效reads進(jìn)行de novo拼接，統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生51，270個(gè)長(zhǎng)度均大于200bp的transcript，平均長(zhǎng)度為1241bp，N50值為1857bp。對(duì)35

3、，180個(gè)unigenes進(jìn)一步聚類和評(píng)估分析表明他們的平均長(zhǎng)度為1，050 bp，N50值為1626bp。在這些unigenes中有21，882個(gè)長(zhǎng)度大于500bp（占總體62.2％），13，259個(gè)長(zhǎng)度大于1000bp（占總體37.7％）;通過(guò)BLASTX檢索NR蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選糖苷水解酶直系同源基因，篩選到4個(gè)碳水化合物酶家族的524個(gè)酶基因序列:其中包括10個(gè)糖苷水解酶家族的136個(gè)具糖苷水解酶結(jié)構(gòu)域的基因序列，28個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶

4、家族的328個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列，2個(gè)碳水化合物酯酶家族的42個(gè)碳水化合物酯酶基因，3個(gè)碳水化合物結(jié)合模塊家族的18個(gè)碳水化合物結(jié)合模塊基因。
　　RNA經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，根據(jù)篩選到的AbGH16序列設(shè)計(jì)引物，以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行完整閱讀框區(qū)域序列的PCR擴(kuò)增，得到序列長(zhǎng)779bp;BLASTX/BLASTP篩選NCBI登錄的GH16蛋白同源序列8條。應(yīng)用Mega5.05選用WAG模型構(gòu)建的最大擬自然樹(shù)明顯分為兩

5、支。對(duì)NCBI收錄的所有GH16蛋白同源序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明:AbGH16蛋白與真菌GH16蛋白親緣關(guān)系近;經(jīng)ORF分析得到蛋白質(zhì)序列，含有259個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量29.066，等電點(diǎn)為8.11。通過(guò)SignalP4.1 Server對(duì)貝西滑刃線蟲(chóng)AbGH16蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域分析表明在該蛋白質(zhì)的N端1～20個(gè)氨基酸區(qū)段具有跨膜結(jié)構(gòu)域;Hphob./Kyte&Doolittle分析表明，該區(qū)段氨基酸序列疏水性強(qiáng)，說(shuō)明該蛋白質(zhì)

6、是分泌蛋白;蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析表明， AbGH16蛋白屬于葡聚糖內(nèi)切酶。進(jìn)一步結(jié)構(gòu)分析表明，源自貝西滑刃線蟲(chóng)的AbGH16蛋白以及松材線蟲(chóng)GH16蛋白結(jié)構(gòu)相似。AbGH16蛋白與源自草酸青霉的GH16三維結(jié)構(gòu)相對(duì)松材線蟲(chóng)而言更為相似，這兩個(gè)蛋白質(zhì)在兩個(gè)連續(xù)的反向平行的β折疊中間均出現(xiàn)小α螺旋結(jié)構(gòu)。而與源自細(xì)菌的GH16三維結(jié)構(gòu)，具有4個(gè)β折疊的差異，推想貝西滑刃線蟲(chóng)AbGH16基因從真菌基因平移而來(lái)。
　　本研究應(yīng)用原位雜交技術(shù)來(lái)

7、確定糖苷水解酶基因16在線蟲(chóng)體內(nèi)的表達(dá)部位。地高辛(Digoxin)標(biāo)記的來(lái)源自AbGH16基因的正義探針原位雜交，沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)。地高辛標(biāo)記的來(lái)源自AbGH16基因的反義探針原位雜交，在貝西滑刃線蟲(chóng)食道腺區(qū)域顯示出明顯信號(hào);這一結(jié)果表明，該基因確實(shí)是貝西滑刃線蟲(chóng)基因，該基因在食道腺表達(dá)。
　　通過(guò)熒光定量PCR來(lái)檢測(cè)不同株系貝西滑刃線蟲(chóng)糖苷水解酶16基因的表達(dá)量。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，GH16的相對(duì)表達(dá)量與其致病性正相關(guān)，致病性強(qiáng)的蟲(chóng)株G