基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的中華鱉微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)及MSTN基因的克隆表達(dá).pdf

1、中華鱉(Pelodiscus Sinensis),隸屬于爬行綱(Reptilia)、龜鱉目(Testudinata)、鱉科(Trionychidae)、鱉屬(Pelodiscus),其肉質(zhì)鮮嫩、風(fēng)味鮮美獨(dú)特,自古以來就是深受消費(fèi)者喜愛的滋補(bǔ)珍品。近年來隨著生活水平的提高,中華鱉的消費(fèi)量呈逐年上升趨勢(shì),其養(yǎng)殖規(guī)模也逐年擴(kuò)大。然而自上世紀(jì)九十年代以來,由于大量境外走私鱉涌入我國,加之各養(yǎng)殖場間相互引種、和近親繁殖,導(dǎo)致中華鱉的種質(zhì)性狀出現(xiàn)退

2、化,嚴(yán)重影響了中華鱉產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,因此種質(zhì)保護(hù)和良種選育是中華鱉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)亟待解決的重要課題。為此本文采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),開發(fā)了與生長性狀相關(guān)的中華鱉EST-SSR標(biāo)記,分析了與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)的基因位點(diǎn),并對(duì)中華鱉四個(gè)不同養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性進(jìn)行了分析;開展了中華鱉MSTN(Myostatin)基因的克隆及表達(dá)分析,為尋找挖掘中華鱉生長性狀相關(guān)基因的分子結(jié)構(gòu)和功能,及其遺傳育種等工作奠定了一定的科學(xué)基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：

3、r>　　⑴基于中華鱉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)、驗(yàn)證。根據(jù)中華鱉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的文庫序列,通過MSATCOMMANDER來檢索全部非冗余unigenes中的SSR位點(diǎn),并通過PRIMER3軟件來設(shè)計(jì)PCR引物,再根據(jù)基因注釋及 GO二級(jí)分類的結(jié)果,挑選分類中生長(growth progress)、增殖(reproduction progress)、代謝(metabolism progress)三個(gè) GO二級(jí)分類條目中isoge

4、ne上的SSR位點(diǎn)所設(shè)計(jì)的100對(duì)引物,進(jìn)行多態(tài)性的驗(yàn)證,從中篩選得到了15對(duì)多態(tài)性引物,對(duì)太湖鱉、日本鱉、黃河鱉、淮河鱉4個(gè)中華鱉養(yǎng)殖群體進(jìn)行基因掃描、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析和多樣性檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)各個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因頻率(P)、等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、哈德溫伯格平衡PHW、多態(tài)性信息含量PIC。同時(shí),采用MEGA3.2軟件繪制基于Nei氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離的UPGMA系統(tǒng)進(jìn)化樹。分析統(tǒng)計(jì)

5、結(jié)果如下：①中華鱉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組裝和拼接后共得到85246條unigenes,其中在15319個(gè)(17.97％)unigenes中共檢索到19452個(gè)SSR位點(diǎn),微衛(wèi)星分布的頻率和密度分別是22.82％和177 per Mb,共有11801個(gè)位點(diǎn)(61％)被成功設(shè)計(jì)獲得引物,從三個(gè)GO二級(jí)分類條目上的isogene上的SSR位點(diǎn)中隨機(jī)篩選設(shè)計(jì)的100對(duì)引物,經(jīng)過驗(yàn)證,23對(duì)表現(xiàn)為多態(tài)性。②15對(duì)引物對(duì)四個(gè)中華鱉群體120只個(gè)體進(jìn)行基因掃描

6、共得到354個(gè)等位基因,每個(gè)位點(diǎn)得到的等位基因數(shù)從2至7個(gè)不等,平均等位基因數(shù)為2.95,平均有效等位基因數(shù)為2.46;平均觀測(cè)雜合度為0.40,平均期望雜合度為0.55,平均多態(tài)性信息含量為0.48,達(dá)到中度多態(tài)水平(0.5>P>0.25)。③黃河鱉與日本鱉之間遺傳距離最大(0.157),遺傳相似系數(shù)最小(0.8547),說明兩者親緣關(guān)系較遠(yuǎn);黃河群體與淮河群體遺傳距離最小(0.0841),遺傳相似系數(shù)最大(0.9194),說明兩者親

7、緣關(guān)系較近。聚類分析結(jié)果表明:黃河鱉和淮河鱉先聚為一支,然后與太湖鱉聚合,最后才與日本鱉聚合。
　?、浦腥A鱉EST-SSR標(biāo)記與生長性狀關(guān)聯(lián)性分析。采用中華鱉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開發(fā)的15對(duì)多態(tài)性EST-SSR引物,對(duì)60只中華鱉的體長、體重、背甲長和裙邊寬4種生長性狀進(jìn)行標(biāo)記-性狀相關(guān)性研究,結(jié)果表明:C8387位點(diǎn)分別與體長、體重、背甲長和裙邊寬顯著相關(guān)(P<0.05)和極顯著相關(guān)(P<0.01),CC型、AB型分別為4種性狀的優(yōu)勢(shì)、劣

8、勢(shì)基因型;C211位點(diǎn)分別與體重、背甲長和裙邊寬呈極顯著相關(guān)(P<0.01)和顯著相關(guān)(P<0.05),其中等位基因C與體重呈負(fù)相關(guān),CC型是裙邊寬、背甲長性狀的劣勢(shì)基因型,而BB型和AB型分別是裙邊寬和體重的優(yōu)勢(shì)基因型;C5670位點(diǎn)與體重和背甲長分別呈極顯著相關(guān)(P<0.01)和顯著相關(guān)(P<0.05),其中BB型和AA型分別是體重和背甲長的優(yōu)勢(shì)、劣勢(shì)基因型;C1312和 C13038位點(diǎn)均與體重、背甲長極顯著相關(guān)(P<0.01),

9、且C1312上的BC型、C13038上的BB型分別是中華鱉體重、背甲長性狀的優(yōu)勢(shì)基因型。
　?、侵腥A鱉MSTN基因的克隆及表達(dá)分析。根據(jù)中華鱉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的部分MSTN cDNA片段設(shè)計(jì)引物,對(duì)其5’端和3’端分別進(jìn)行RACE(cDNA末端快速克隆),獲得MSTN的cDNA全長,并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,還利用RT-PCR技術(shù)研究了MSTN基因在中華鱉不同年齡、不同組織中的表達(dá)情況,結(jié)果表明：①中華鱉 MSTN基因的cDNA全長

10、為2301bp,包含69bp的5’非編碼區(qū)(5’-UTR)、1128bp的開放閱讀框,共編碼375個(gè)氨基酸、1084bp的3’非編碼區(qū)(3’-UTR),且3’-UTR具有明顯的終止密碼子 TGA、加尾信號(hào) AATAAA及多聚 A尾巴;其中C端生物活性區(qū)含有9個(gè)保守的半胱氨酸殘基;RSRR為蛋白水解加工位點(diǎn);中華鱉MSTN基因編碼的蛋白屬于跨膜蛋白,蛋白上存在一個(gè)分泌信號(hào)肽結(jié)構(gòu),該蛋白由6個(gè)α-螺旋和16個(gè)β-折疊片組成,三維同源建模的結(jié)

11、果符合TGF-β超家族的特征。中華鱉MSTN cDNA序列經(jīng)過氨基酸序列比對(duì),與西部錦龜(Chrysemys picta bellii)、綠海龜(Chelonia mydas)、火雞(Meleagris gallopavo)、雞(Gallus gallus)、綠頭鴨(Anas platyrhynchos)、人(Homo sapiens)、短尾等的相似度達(dá)到了80％~99％。②MSTN在中華鱉每個(gè)組織中都有一定量的表達(dá),其相對(duì)表達(dá)量的高低

12、依次為:大腿肌>心肌>肝臟>腦>腎臟>脾臟,其中在大腿肌中MSTN的表達(dá)量相對(duì)強(qiáng)度值為0.6064,且顯著高于其他5種組織(P<0.05),而心肌和肝臟其次,分別為0.146和0.1196,而腎臟和脾臟中的表達(dá)量相對(duì)值最低,僅為0.0346和0.0289;除了大腿肌和心肌之外,其他5種組織之間差異不顯著(P>0.05)。③MSTN基因在中華鱉各個(gè)年齡段都有表達(dá),且隨著年齡增長呈先升高再降低的趨勢(shì),其中3齡中華鱉MSTN表達(dá)水平相對(duì)最高,