貝西滑刃線蟲效應(yīng)因子AB-Gpero基因克隆及功能研究.pdf

1、植物寄生線蟲(Plant Parasitic Nematodes，Phytonematodes)是指寄生于植物的各組織中，影響植物正常生長發(fā)育，造成植物出現(xiàn)疾病癥狀的一類線蟲。它通過口針刺入植物細(xì)胞、分泌效應(yīng)蛋白（Effector Protein），修改植物細(xì)胞、攝取營養(yǎng)物質(zhì)以維持自身生長發(fā)育?？刂菩?yīng)蛋白表達(dá)的效應(yīng)因子(Effector)，廣泛純在于植物寄生線蟲中，在線蟲整個生長發(fā)育及侵染寄生中起到重要作用。深入研究線蟲效應(yīng)因子功能，

2、了解線蟲與宿主植物間的作用機(jī)制，對如何防治線蟲侵染宿主植物，減少經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。目前，對線蟲效應(yīng)因子研究已成為線蟲研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以貝西滑刃線蟲(Aphelenchoides bessseyi Christie)為供試材料，從效應(yīng)因子Ab-Gpero（貝西滑刃線蟲谷胱甘肽過氧化物酶基因）入手，利用RACE擴(kuò)增法，克隆了貝西滑刃線蟲上的該基因，利用原位雜交技術(shù)定位基因，了解效應(yīng)因子的功能位置，利用RNAi技術(shù)分析其功能，了解效應(yīng)因

3、子在貝西滑刃線蟲繁殖、侵染方面的作用。為將來開展貝西滑刃線蟲生物防治工作提供新思路。
　　目的基因的克隆。提取貝西滑刃線蟲RNA，構(gòu)建第一鏈cDNA，利用生物信息學(xué)篩選靶標(biāo)基因的EST序列，設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR、測序及NCBI中Blast比對確定為所研究基因的部分序列（Ab-Gpero片段基因大小為408bp）。根據(jù)獲得的序列，設(shè)計(jì)新引物，用RACE法克隆目的基因cDNA全長序列，進(jìn)行基因分析。
　　原位雜交分析Ab-

4、Gpero基因的表達(dá)位置。根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)特異探針，利用原位雜交確定基因表達(dá)位置。結(jié)果顯示Ab-Gpero基因的表達(dá)位置在背食道腺上，分析了基因功能位點(diǎn)。
　　RNAi分析Ab-Gpero基因的功能。利用T7RNA聚合酶合成dsRNA，純化后將dsRNA侵泡導(dǎo)入供試貝西滑刃線蟲體內(nèi)，dsRNA量與線蟲樣量相當(dāng)。24小時后，將dsRNA處理的線蟲和未經(jīng)dsRNA處理的線蟲轉(zhuǎn)接到胡蘿卜培養(yǎng)基上，觀察其對胡蘿卜愈傷組織的侵染狀況。發(fā)現(xiàn)d