來氟米特活性代謝產(chǎn)物A771726對高糖誘導(dǎo)足細胞凋亡的影響及機制研究.pdf

1、目的：
　　 1.觀察培養(yǎng)的人腎小球足細胞（human glomerular podocyte）形態(tài)學(xué)，掌握細胞培養(yǎng)的基本操作過程。
　　 2.觀察來氟米特活性代謝產(chǎn)物A771726對高糖誘導(dǎo)足細胞凋亡影響，探討來氟米特對足細胞損傷的保護作用及可能的機制。
　　 方法：
　　 實驗中應(yīng)用的足細胞是一種溫度敏感型永生化人足細胞系。細胞復(fù)蘇后在含1％ITS、10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，33℃、5％CO2

2、條件下傳代增生，細胞呈鵝卵石狀，之后轉(zhuǎn)入37℃、5％C02 培養(yǎng)箱培養(yǎng)兩周，使其進入成熟分化狀態(tài)，待細胞生長融合約至70％-80％時，換無血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，待細胞生長同步后分組。將足細胞分為正常糖組、甘露醇高滲對照組、高糖組、高糖+SB202190（p38MAPK通路特異性抑制劑）組及高糖+A771726（來氟米特活性代謝產(chǎn)物）組。Western 印跡檢測足細胞p38MAPK及磷酸化p38MAPK（p-p38）活性

3、；流式細胞儀檢測各實驗組足細胞凋亡率。
　　 結(jié)果：
　　 1.我們檢測到高糖刺激足細胞在10min時p38MAPK信號通路即開始活化，p-p38蛋白表達增加，30min 達高峰，6h 接近基礎(chǔ)水平；而正常糖組和高滲對照組僅有極少量p38 活化；應(yīng)用p38MAPK信號通路特異性阻斷劑SB202190可明顯降低高糖刺激引起的p-p38蛋白表達，來氟米特活性代謝產(chǎn)物A771726 亦可減少同一時間點高糖刺激引起的p-p38蛋

4、白表達。
　　 2.流式細胞儀檢測到高糖刺激24h 以上可見明顯細胞凋亡，24h 凋亡率為（12.3±0.96）％，48h為（18.6±0.70）％，以48h 凋亡最為明顯，顯著高于正常糖組及甘露醇高滲對照組。p38MAPK 特異性抑制劑SB202190組48h 足細胞凋亡率為（13.4±0.85）％，較高糖48h組下降26％；來氟米特活性代謝產(chǎn)物A771726 可以減輕高糖誘導(dǎo)的足細胞凋亡，20μmol/L來氟米特活性代謝產(chǎn)物