Notch以及相關(guān)分子在呼吸道病毒疫苗刺激的樹突細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的：呼吸道合胞病毒(RSV)是嬰幼兒下呼吸道感染的最重要病原，主要引起肺炎和哮喘綜合征等，嚴(yán)重感染者會發(fā)生呼吸衰竭。接種疫苗是重要的預(yù)防措施，世界衛(wèi)生組織已將RSV疫苗定為最優(yōu)先發(fā)展的疫苗之一。十九世紀(jì)六十年代福爾馬林滅活的RSV疫苗(FI-RSV)被批準(zhǔn)進(jìn)行臨床試驗，接種對象是兩個月至七歲的幼兒，當(dāng)RSV流行時，與未接種者相比，接種者不僅沒被保護(hù)，反而發(fā)生了更嚴(yán)重的肺部免疫病理反應(yīng)，并造成兩例死亡。這種疫苗增強(qiáng)性肺部免疫病理的發(fā)病機(jī)

2、制目前尚不清楚，大量研究表明：固有免疫在疫苗增強(qiáng)性肺部免疫病理中發(fā)揮著重要作用。樹突狀細(xì)胞(DC)是重要的固有免疫細(xì)胞，而且是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要橋梁。Notch信號是一種介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間局部信號傳遞的機(jī)制，對細(xì)胞的命運起決定性作用。最近發(fā)現(xiàn)：在對病原和疫苗的應(yīng)答過程中，Notch信號對DC和T細(xì)胞等外周免疫細(xì)胞的激活和分化方向起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。RSV的天然宿主是人和靈長類，小鼠模型不能復(fù)制人類感染RSV的臨床癥狀和炎癥病理

3、反應(yīng)；而與RSV同病毒屬的小鼠肺炎病毒(PVM)感染的小鼠與RSV感染的嬰幼兒的癥狀及病理反應(yīng)相一致；用PVM攻擊福爾馬林滅活的PVM(FI-PVM)免疫的小鼠，即FI-PVM/PVM/小鼠模型，最近已經(jīng)被用于RSV疫苗增強(qiáng)性肺部免疫病理機(jī)制的研究。本課題用FI-PVM體外刺激小鼠DC，研究Notch配體、受體以及相關(guān)的細(xì)胞因子在DC中的表達(dá)，為研究疫苗增強(qiáng)的肺部免疫病理的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：培養(yǎng)小鼠骨髓來源DC、BHK

4、-21細(xì)胞，傳代培養(yǎng)PVM病毒，制備FI-PVM疫苗。合成佐劑CpG2216。用PVM、FI-PVM以及FI-PVM+CpG2216刺激小鼠DC，分別于2小時、6小時、18小時收集細(xì)胞，提取RNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測；收集刺激18小時的細(xì)胞，提取總蛋白，用Western-blot進(jìn)行蛋白水平檢測；用熒光抗體標(biāo)記刺激后的DC，用流式細(xì)胞儀檢測MHC-Ⅱ分子和共刺激分子的表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴測定出病毒滴度，確定了病毒、疫苗、佐劑的

5、使用量；⑵成功分化出小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(BMDC)；⑶實時定量PCR檢測Notch、Notch配體、細(xì)胞因子IL-6、趨化因子RANTES的結(jié)果顯示：與對照組相比，疫苗FI-PVM刺激的小鼠DC可于不同時間點高表達(dá)Notch配、受體及相關(guān)的細(xì)胞因子和趨化因子，特別是疫苗FI-PVM聯(lián)合佐劑CpG2216刺激DC表達(dá)的Notch2-4、Delta4和Jagged1-2顯著高于對照組和單獨FI-PVM刺激的DC。趨化因子MCP-3的檢

6、測結(jié)果顯示：單獨FI-PVM刺激的DC分泌的MCP-3未見升高，但FI-PVM聯(lián)合佐劑CpG2216刺激DC高表達(dá)MCP-3。⑷Western-blot結(jié)果顯示：FI-PVM聯(lián)合佐劑CpG2216刺激DC18小時后Notch1、Notch2、配體Delta4和靶基因HES-1的蛋白表達(dá)量高于對照組和其它各組。此結(jié)果與RT-PCR檢測結(jié)果一致。⑸流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：不同刺激因素處理組，在刺激18小時后細(xì)胞表面MHC-Ⅱ分子和CD80分