杜仲葉抗疲勞功效分子機(jī)制與抗氧化作用關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、杜仲(Eucommia ulmoides)在我國(guó)有著悠久的藥用歷史，其具有降血壓、補(bǔ)腎、益肝、強(qiáng)筋骨及安胎等功效。杜仲作為中藥材的使用部位是杜仲皮，然而現(xiàn)代研究表明，杜仲葉與杜仲皮的成分含量相近，甚至某些成分含量較杜仲皮高。因此，杜仲葉可以代皮入藥，這為解決杜仲皮資源匱乏、杜仲資源綜合利用提供了很好的途徑。
　　 研究表明，杜仲葉具有抗疲勞功效，但是目前所見的相關(guān)報(bào)道大多是以杜仲葉粗提物為研究對(duì)象，并且抗疲勞功效成分尚不明確，抗

2、疲勞作用機(jī)理也不清楚。所以，目前以杜仲葉為原料開發(fā)的抗疲勞功能食品仍屬于第二代保健食品，這類保健食品存在作用機(jī)理不清楚、功效成分不明確的問題。
　　 針對(duì)上述問題，本課題以杜仲葉為研究對(duì)象，對(duì)杜仲葉功效成分逐步進(jìn)行分離純化，采用動(dòng)物試驗(yàn)評(píng)價(jià)各步產(chǎn)物的抗疲勞功效，以篩選出成分更加明確的杜仲葉抗疲勞功效成分。同時(shí)，分析各分離純化產(chǎn)物體內(nèi)和體外抗氧化作用，進(jìn)一步研究杜仲葉抗疲勞功效與抗氧化作用之間的關(guān)聯(lián)性，探索杜仲葉抗疲勞作用機(jī)理。最

3、后，將最終得到的具有抗疲勞功效的杜仲葉純化產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)致的分離，得到單體化合物，采用紅外光譜和紫外光譜測(cè)定各單體的結(jié)構(gòu)式，初步推測(cè)其分子結(jié)構(gòu)，從分子水平上闡釋杜仲葉抗疲勞作用機(jī)理。
　　 本論文完成的研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1．杜仲葉粗提物試驗(yàn)
　　 抗疲勞功效評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，杜仲葉水提物(EUH)和醇提物(EUE)均能顯著延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、降低血乳酸(LA)和血清尿素氮(SUN)含量及提高肝糖原含量，但EUE對(duì)各

4、抗疲勞功效評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響比EUH顯著，表明EUE的抗疲勞功效強(qiáng)于EUH。
　　 常壓耐缺氧試驗(yàn)結(jié)果顯示，EUH和EUE不能明顯地提高小鼠常壓耐缺氧能力，因此，EUH和EUE并不能通過改善常壓耐缺氧能力表現(xiàn)抗疲勞功效。
　　 體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果顯示，EUH和EUE均具有不同程度的清除羥自由基(·OH)、超氧陰離子(O2-·)及1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·)的作用，但是EUE對(duì)各自由基的清除效果均優(yōu)于EUH，

5、這與EUE的抗疲勞功效強(qiáng)于EUH的結(jié)論相一致，證明杜仲葉粗提物體外抗氧化作用與抗疲勞功效正相關(guān)。
　　 試驗(yàn)結(jié)果還表明，杜仲葉粗提物中的總黃酮與總多酚可能為杜仲葉粗提物表現(xiàn)抗疲勞功效和體外抗氧化作用的功效成分。
　　 2．杜仲葉一次分離純化產(chǎn)物試驗(yàn)
　　 抗疲勞功效評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，20％乙醇洗脫液(EUlⅠ)和60％乙醇洗脫液(EUlⅡ)均能延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、降低血LA和SUN含量及提高肝糖原含量，但EUlⅠ對(duì)

6、各抗疲勞功效評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響比EUlⅡ顯著，表明EUlⅠ具有強(qiáng)于EUlⅡ的抗疲勞功效。同時(shí)，EUlⅠ可以顯著提高乳酸脫氫酶(LDH)的活性，表明EUlⅠ可以通過提高機(jī)體LDH活性降低血LA含量。
　　 體內(nèi)抗氧化作用試驗(yàn)結(jié)果顯示，只有EUlⅠ可以降低丙二醛(MDA)含量、提高超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性，而EUlⅡ?qū)@三項(xiàng)指標(biāo)的影響并不明顯，表明EUlⅠ具有比EUlⅡ更顯著的體內(nèi)抗氧化作用，這與

7、EUlⅠ的抗疲勞功效強(qiáng)于EUlⅡ的結(jié)論相一致，證明杜仲葉一次分離純化產(chǎn)物體內(nèi)抗氧化作用與抗疲勞功效正相關(guān)。
　　 常壓耐缺氧試驗(yàn)結(jié)果顯示，EUlⅠ和EUlⅡ不能明顯地提高小鼠常壓耐缺氧能力，因此，EUlⅠ和EUlⅡ不能通過改善常壓耐缺氧能力表現(xiàn)抗疲勞功效。
　　 體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果顯示，EUlⅠ和EUlⅡ均具有不同程度的清除·OH、O2-·及DPPH的作用，但是EUlⅠ對(duì)各自由基的清除效果均優(yōu)于EUlⅡ，表明EUlⅠ具有

8、比EUlⅡ更顯著的體外抗氧化作用，這與EUlⅠ的抗疲勞功效強(qiáng)于EUlⅡ的結(jié)論相一致，證明杜仲葉一次分離純化產(chǎn)物體外抗氧化作用與抗疲勞功效正相關(guān)。量效關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果表明，EUlⅠ和EUlⅡ的體外抗氧作用具有很好的量效關(guān)系。
　　 試驗(yàn)結(jié)果還表明，多酚類物質(zhì)可能為杜仲葉一次分離純化產(chǎn)物表現(xiàn)抗疲勞功效和抗氧化作用的主要功效成分。
　　 3．杜仲葉二次分離純化產(chǎn)物試驗(yàn)
　　 抗疲勞功效評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，乙酸乙酯萃取物(EU2Ⅰ

9、)和正丁醇萃取物(EU2Ⅱ)對(duì)小鼠體重有一定的影響。EU2Ⅰ和EU2Ⅱ均能延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、降低血LA含量及提高肝糖原含量，但只有EU2Ⅱ可以顯著降低SUN含量，EU2Ⅱ?qū)Ω骺蛊诠πгu(píng)價(jià)指標(biāo)的影響比EU2Ⅰ顯著，表明EU2Ⅱ具有強(qiáng)于EU2Ⅰ的抗疲勞功效。同時(shí)，只有EU2Ⅱ可以顯著提高LDH活性，表明EU2Ⅱ可以通過提高機(jī)體LDH活性降低血LA含量。
　　 體內(nèi)抗氧化作用試驗(yàn)結(jié)果顯示，EU2Ⅰ和EU2Ⅱ均可以降低MDA含量，

10、但是，只有EU2Ⅱ可以顯著提高SOD和GSH-PX活性，表明EU2Ⅱ具有比EU2Ⅰ更顯著的體內(nèi)抗氧化作用，這與EU2Ⅱ的抗疲勞功效強(qiáng)于EU2Ⅰ的結(jié)論相一致，證明杜仲葉二次分離純化產(chǎn)物體內(nèi)抗氧化作用與抗疲勞功效正相關(guān)。
　　 常壓耐缺氧試驗(yàn)結(jié)果顯示，EU2Ⅰ和EU2Ⅱ不能明顯地提高小鼠常壓耐缺氧能力，因此，EU2Ⅰ和EU2Ⅱ不能通過改善常壓耐缺氧能力表現(xiàn)抗疲勞功效。
　　 體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果顯示，EU2Ⅰ和EU2Ⅱ均具有不

11、同程度的清除·OH、O2-·及DPPH的作用，但是EU2Ⅱ?qū)Ω髯杂苫那宄Ч绕滹@著，表明EU2Ⅱ具有更為顯著的體外抗氧化作用，這與EU2Ⅱ具有更明顯的抗疲勞功效的結(jié)論相一致，證明杜仲葉二次分離純化產(chǎn)物體外抗氧化作用與抗疲勞功效正相關(guān)。量效關(guān)系試驗(yàn)表明，EU2Ⅰ和EU2Ⅱ的體外抗氧作用具有很好的量效關(guān)系。
　　 試驗(yàn)結(jié)果還表明，多酚類物質(zhì)可能為杜仲葉二次分離純化產(chǎn)物表現(xiàn)抗疲勞功效和抗氧化作用的主要功效成分。
　　 4．

12、杜仲葉三次分離純化產(chǎn)物試驗(yàn)
　　 抗疲勞功效評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，黃酮純化產(chǎn)物(EU3Ⅰ)和綠原酸純化產(chǎn)物(EU3Ⅱ)均能延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，但是只有EU3Ⅰ可以顯著降低血LA和SUN含量及提高肝糖原含量，EU3Ⅰ對(duì)各抗疲勞功效評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響比EU3Ⅱ顯著，表明EU3Ⅰ具有明顯的抗疲勞功效。同時(shí)，只有EU3Ⅰ可以顯著提高LDH活性，表明EU3Ⅰ可以通過提高機(jī)體LDH活性降低由血LA含量。
　　 體內(nèi)抗氧化作用試驗(yàn)結(jié)果顯示，EU

13、3Ⅰ和EU3Ⅱ均可以降低MDA含量，但是，只有EU3Ⅱ可以顯著提高SOD和GSH-PX活性，證明EU3Ⅱ具有更為明顯的體內(nèi)抗氧化作用。
　　 常壓耐缺氧試驗(yàn)結(jié)果顯示，EU3Ⅰ可以提高小鼠常壓耐缺氧能力，而EU3Ⅱ不能明顯地提高小鼠常壓耐缺氧能力。因此，EU3Ⅰ可能是通過提高小鼠常壓耐缺氧能力表現(xiàn)抗疲勞功效，而EU3Ⅱ不能通過改善常壓耐缺氧能力表現(xiàn)抗疲勞功效。
　　 體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果顯示，EU2Ⅰ和EU2Ⅱ均具有不同程度

14、的清除·OH、O2-·及DPPH的作用，但是EU3Ⅱ?qū)Ω髯杂苫那宄Ч绕滹@著，表明EU3Ⅱ具有更強(qiáng)的體外抗氧化能力。量效關(guān)系實(shí)驗(yàn)表明，EU3Ⅰ和EU3Ⅱ的體外抗氧能力同樣具有很好的量效關(guān)系。
　　 試驗(yàn)結(jié)果表明，EU3Ⅰ（黃酮類物質(zhì)）可能是通過改善機(jī)體能量代謝提高機(jī)體抗疲勞能力；而EU3Ⅱ（綠原酸）可能是通過對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響或者是與杜仲葉中多種成分協(xié)同作用的方式提高機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐受力．
　　 5．杜仲葉抗疲勞功效成分鑒

15、定
　　 采用硅膠柱層析和薄層層析的方法對(duì)杜仲葉正丁醇萃取純化產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化和分析，得到6種單體化合物，經(jīng)紅外光譜和紫外光譜初步鑒定，其中4種可能為槲皮素、表兒茶素、綠原酸和蘆丁，另外2種初步推測(cè)為黃酮苷和黃酮類化合物。
　　 從杜仲葉正丁醇萃取物中分離出的化合物多為黃酮和多酚類物質(zhì)，這些成分具有顯著的抗氧化活性。由此可見，抗氧化功效成分的存在使杜仲葉表現(xiàn)出了抗氧化作用，并且使杜仲葉顯示了抗疲勞功效。