在自噬功能障礙情況下Nrf2調(diào)節(jié)失代償性心臟重構(gòu)及功能障礙的機(jī)制研究.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子NE-2相關(guān)因子2（Nrf2）是堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子Cap‘n’Coall(CNC)家族的成員，Nrf2通過(guò)與一種順式增強(qiáng)子序列結(jié)合，我們稱之為抗氧化反應(yīng)元件(ARE)，其核心核苷酸序列為‘5-RTGACNNNGC-3’，與這種增強(qiáng)子結(jié)合可啟動(dòng)200多種歸屬于不同領(lǐng)域的基因的表達(dá)，包括抗氧化基因、Ⅱ相解毒酶、轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、清道夫受體以及分子伴侶蛋白等等。因此，Nrf2具有廣泛而復(fù)雜的生物學(xué)功能，從經(jīng)典的抗氧化防御，到細(xì)胞

2、周期的調(diào)控和蛋白質(zhì)量的控制。
　　Nrf2對(duì)心臟的保護(hù)作用已經(jīng)在許多動(dòng)物模型中證實(shí)，包括以主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)(TAC)引發(fā)心臟壓力負(fù)荷增加誘導(dǎo)的失代償性心臟重構(gòu)和心功能障礙模型。從分子水平上分析，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2啟動(dòng)抗氧化蛋白以及解毒蛋白的表達(dá)，從而對(duì)抗氧化應(yīng)激壓力導(dǎo)致的心臟損傷和功能失常。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)Nrf2可促進(jìn)自噬清除毒性的多聚泛素化蛋白聚集體的功能，從而保護(hù)心臟不受細(xì)胞內(nèi)毒性蛋白的損傷。但是，與之前的結(jié)論相反，最近的研究發(fā)現(xiàn)

3、，在一種蛋白聚集誘發(fā)心肌病的小鼠動(dòng)物模型中，這種模型通過(guò)向小鼠基因組內(nèi)導(dǎo)入人來(lái)源的alpha B-晶狀體蛋白基因突變體（hCryABR120G）并進(jìn)行小鼠老齡化實(shí)現(xiàn)，敲除Nrf2基因可以抵御心臟的還原壓力，減少多聚泛素化蛋白在心臟內(nèi)的聚集，減緩心臟病理性肥大，改善心力衰竭。分析原因，持續(xù)性的Nrf2激活可能引發(fā)過(guò)度的還原壓力導(dǎo)致hCryABR120G誘發(fā)的心肌病。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)心肌特異性敲除Nrf2基因的小鼠對(duì)抗了TAC術(shù)后4周的壓

4、力負(fù)荷誘發(fā)的失代償性心臟重構(gòu)和功能障礙，這與Nrf2介導(dǎo)還原壓力的理論相違背。另一方面，前期的研究也證明在自噬功能障礙的狀態(tài)下，Nrf2的激活導(dǎo)致了肝臟的損傷。另外，自噬功能障礙在小鼠CryABR120G(mCryABR120G)基因誘導(dǎo)的心肌病中起了重要作用，mCryABR120G基因和hCryABR120G基因有著幾乎相同的核苷酸序列，且衰老本身也伴隨著自噬功能不足或損傷，從這些關(guān)聯(lián)上看，衰老的hCryABR120G小鼠心臟中Nrf

5、2介導(dǎo)的負(fù)面作用很可能與自噬功能不足有關(guān)。綜上所述，在不同的病理狀態(tài)下，Nrf2對(duì)心臟的作用可能是保護(hù)性的也可能是損傷性的，這種雙面作用確切的機(jī)制目前還沒有研究清楚。
　　在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)心臟中Nrf2基因激活的病理生理學(xué)作用與自噬功能的完整性密切相關(guān)。自噬功能完整時(shí)Nrf2的激活對(duì)心臟的適應(yīng)性反應(yīng)起著重要作用，然而，在自噬功能障礙時(shí)，Nrf2的激活又介導(dǎo)了心臟的失代償性重構(gòu)和功能障礙。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，自噬功能損傷可能是通

6、過(guò)阻斷核內(nèi)Fyn控制的Nrf2向細(xì)胞核外的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而導(dǎo)致了Nrf2在核內(nèi)積聚，啟動(dòng)血管緊張素原的大量表達(dá)，進(jìn)而惡化心臟失代償性重構(gòu)，加重心功能損傷。
　　目的:
　　1、研究Nrf2在TAC手術(shù)誘發(fā)的壓力負(fù)荷引起的心臟重構(gòu)和心功能障礙的病理進(jìn)展過(guò)程中所起的作用;
　　2、研究Nrf2激活對(duì)心臟的作用與自噬功能狀態(tài)之間的關(guān)系;
　　3、探討在不同自噬功能狀態(tài)下，Nrf2影響心臟功能的具體機(jī)制。
　　方法:

7、r>　　第一部分:
　　1、用Nrf2基因敲除小鼠和野生型對(duì)照組小鼠進(jìn)行主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)，建立心衰模型，檢測(cè)術(shù)后存活狀況，在模型的早期EBD檢測(cè)心肌壞死，模型的晚期階段，超聲、qPCR、WGA、Masson、免疫組化檢測(cè)心臟重構(gòu)狀況和心功能，分析不同病理生理學(xué)階段Nrf2基因敲除對(duì)心臟的影響;
　　2、通過(guò)對(duì)TAC術(shù)后的WT小鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行自噬流的檢測(cè)，分析TAC術(shù)后不同階段自噬功能的狀態(tài);
　　3、運(yùn)用心肌特異

8、性Atg5基因敲除小鼠建立自噬功能障礙心臟的TAC模型，觀察在自噬功能障礙時(shí)心臟的病理狀態(tài)以及Nrf2和其下游基因表達(dá)水平。
　　第二部分:
　　1、以qPCR和Western Blot的方法檢測(cè)自噬功能障礙小鼠心臟承受壓力負(fù)荷時(shí)心衰相關(guān)基因Agt的表達(dá)狀況;
　　2、以Western Blot的方法檢測(cè)自噬功能障礙對(duì)小鼠心臟承受壓力負(fù)荷時(shí)各信號(hào)通路激活水平的影響，并與Nrf2基因敲除小鼠心臟壓力負(fù)荷模型相對(duì)比，分析兩

9、者之間的聯(lián)系;
　　3、建立Nrf2/Atg5雙敲小鼠心臟壓力負(fù)荷動(dòng)物模型，以免疫組化、western blot檢測(cè)更具體的分析Nrf2對(duì)壓力誘導(dǎo)心衰的病理生理作用與自噬功能的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　第一部分:
　　1、Nrf2基因敲除加重了TAC手術(shù)誘發(fā)的心臟急性損傷，但使手術(shù)引起的遠(yuǎn)期的心臟重塑和心力衰竭得到了緩解;
　　2、在壓力負(fù)荷引起的心臟病程中，Nrf2激活所起的病理生理學(xué)作用與自噬功能的完整性

10、有關(guān);
　　3、自噬功能障礙的小鼠心臟壓力負(fù)荷增加時(shí)，存在Nrf2的過(guò)度表達(dá)和激活。
　　第二部分:
　　1、在自噬功能缺失的壓力超負(fù)荷心臟中，Nrf2啟動(dòng)Agt的表達(dá);
　　2、在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)損傷的心臟，自噬功能障礙阻斷了TAC誘導(dǎo)的Jak/Fyn通路的激活，使Nrf2向細(xì)胞核外轉(zhuǎn)運(yùn)降解減少。
　　結(jié)論:
　　1、自噬功能完整時(shí)Nrf2激活對(duì)心臟起保護(hù)作用，而當(dāng)自噬功能障礙時(shí)，Nrf2的激活加速了心