化學(xué)合成的海洋甾體YC-1和YC-5對神經(jīng)興奮性損傷和癲癇的影響及機(jī)制研究.pdf

1、在上世紀(jì)八十年代，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)有合成甾體的能力，進(jìn)而提出了神經(jīng)活性甾體的概念。神經(jīng)活性甾體(neuroactive steroids，NASs)是天然存在或者人工合成的在神經(jīng)組織具有活性的所有甾體激素的統(tǒng)稱。神經(jīng)活性甾體對神經(jīng)系統(tǒng)的功能活動有著廣泛的調(diào)節(jié)作用。神經(jīng)活性甾體與神經(jīng)元興奮毒性死亡、凋亡有著密切的關(guān)系，并對學(xué)習(xí)記憶有著重要的影響。 隨著社會的老齡化，阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s Disease，AD)

2、、帕金森氏病(Parkinson’s Disease，PD)、腦缺血等疾病的發(fā)病率呈上升趨勢，這類疾病嚴(yán)重威脅著人們的生命健康并往往伴隨著神經(jīng)元的喪失和學(xué)習(xí)記憶能力的下降。目前，這類疾病尚沒有理想的治療方法。實(shí)驗(yàn)表明體內(nèi)某些甾體激素的水平與此類疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。神經(jīng)活性甾體的替代療法已運(yùn)用于臨床，如雌激素用于AD的治療。但是這些甾體的副作用問題也比較突出。因此，深入研究神經(jīng)元凋亡的機(jī)制，并尋找作用特異、保護(hù)效果好、副作用小的甾體藥物是

3、努力的方向之一。 海洋甾體(又稱甾醇類化合物)是源于海洋生物體內(nèi)的一大類重要的天然化學(xué)成分，它們許多獨(dú)特的結(jié)構(gòu)是陸生生物體內(nèi)所沒有的。迄今為止對海洋甾體的研究重點(diǎn)涉及溶血、抗炎、細(xì)胞毒和抗腫瘤、抗菌、抗真菌、抗病毒等藥理特性。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明，從南沙群島唇軟珊瑚中提取的四羥基甾醇(氧代固醇)類化合物YC-1能夠抑制低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡，這是首次報道海洋甾體具有神經(jīng)保護(hù)作用。然而，由于YC-1從南沙群島唇軟珊瑚等少數(shù)

4、海洋生物中提取得到，采集不易和越來越嚴(yán)格的海洋環(huán)境保護(hù)使其來源十分有限，而且YC-1在這些生物體內(nèi)的含量極微，加上提取步驟煩瑣低效，造成天然品YC-1的純度有限、成本相當(dāng)昂貴，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，大大阻礙了對YC-1藥理學(xué)機(jī)制的深入研究。目前，本實(shí)驗(yàn)室以廉價的豬去氧膽酸為原料，通過化學(xué)合成的方法得到了YC-1及其類似物YC-5。本文豐要是探討化學(xué)合成的海洋甾體YC-1和YC-5在體外細(xì)胞水平對神經(jīng)元興奮性毒性損傷的保護(hù)作用，及其對癲癇發(fā)

5、生的影響，并對它們的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，同時希望能為海洋甾體作用機(jī)制的闡明和防治中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的新藥開發(fā)提供線索和幫助。本章建立了谷氨酸誘導(dǎo)的小腦顆粒和皮層神經(jīng)元的興奮性毒性損傷模型，觀察人工合成的海洋甾體YC-1和YC-5對谷氨酸引起的神經(jīng)興奮性毒性有無保護(hù)作用，并從細(xì)胞內(nèi)鈣濃度和細(xì)胞膜Ca2+內(nèi)向電流的變化探討其可能機(jī)制。 方法：大鼠小腦顆粒神經(jīng)元和皮層神經(jīng)元的分離和原代培養(yǎng)；相差顯微鏡(phase contrast

6、microscopy)觀察神經(jīng)元的胞體及突起形態(tài)變化；Hoechst 33258染色觀察神經(jīng)元胞核及染色質(zhì)的形態(tài)變化；二乙酸熒光素(fluorescein diacetate，F(xiàn)DA)染色檢測神經(jīng)元的代謝活性(metabolic activity)和存活率(viability)；LDH釋放實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞的損傷程度；Confocal測定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化和全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)測定細(xì)胞膜Ca2+電流的變化來探討YC-1和YC-5的在谷氨酸誘導(dǎo)

7、的神經(jīng)元興奮性毒性損傷中的作用機(jī)制；定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果以-x±s表示，采用t檢驗(yàn)和方差分析。 結(jié)果：FDA活細(xì)胞染色、Hoechst 33258核染色、LDH釋放量的測定表明YC-1和YC-5能夠抑制谷氨酸誘導(dǎo)的小腦顆粒和皮層神經(jīng)元的興奮性神經(jīng)毒性。相同劑量下(10 μM)，YC-1的抑制效應(yīng)要強(qiáng)于YC-5；YC-1和YC-5可以抑制谷氨酸引起的皮層神經(jīng)元的胞內(nèi)Ca2+濃度的增加，并可以抑制谷氨酸引起的皮層神經(jīng)元細(xì)胞膜的Ca2+電流。

8、 結(jié)論：化學(xué)合成的海洋甾體YC-1和YC-5能夠抑制谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元興奮性毒性損傷，這一作用可能是通過抑制NMDA受體激活，進(jìn)而抑制其引起的胞內(nèi)Ca2+濃度的增加來實(shí)現(xiàn)的。 本章建立了海人酸誘導(dǎo)的小腦顆粒和海馬神經(jīng)元的興奮性毒性損傷模型，觀察人工合成的海洋甾體YC-1和YC-5對海人酸引起的神經(jīng)毒性有無保護(hù)作用，并從細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化探討其效應(yīng)的可能機(jī)制。 方法：大鼠小腦顆粒神經(jīng)元和海馬神經(jīng)元的分離和原代

9、培養(yǎng)；相差顯微鏡(phase contrast microscopy)觀察神經(jīng)元的胞體及突起形態(tài)變化；Hoechst 33258染色觀察神經(jīng)元胞核及染色質(zhì)的形態(tài)變化；二乙酸熒光素(fluorescein diacetate，F(xiàn)DA)染色檢測神經(jīng)元的代謝活性(metabolic activity)和存活率(viability)；LDH釋放實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞的損傷程度；Confocal測定胞內(nèi)Ca2+濃度變化探討YC-1在海人酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元興奮性

10、毒性損傷中的作用機(jī)制；定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果以-x±s表示，采用t檢驗(yàn)和方差分析。 結(jié)果： FDA活細(xì)胞染色、Hoechst33258核染色、LDH釋放量的測定表明YC-1和YC-5能夠抑制海人酸誘導(dǎo)的小腦顆粒和海馬神經(jīng)元的興奮性神經(jīng)毒性。相同劑量下(10 μM)，YC-1的抑制效應(yīng)要強(qiáng)于YC-5；YC-1可以抑制海人酸引起的海馬神經(jīng)元胞內(nèi)Ca2+濃度的增加。 結(jié)論：化學(xué)合成的海洋甾體YC-1和YC-5能夠抑制海人酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元興

11、奮性毒性損傷，這一作用可能足通過抑制海人酸引起的非NMDA受體激活，抑制其引起的胞內(nèi)Ca2+濃度的增加來實(shí)現(xiàn)的。 在前兩章中，我們分別在谷氨酸和海人酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元興奮性毒性損傷模型中觀察了化學(xué)合成的海洋甾體YC-1和YC-5的保護(hù)作用，本章主要觀察化學(xué)合成的海洋甾體YC-1脂質(zhì)體對海人酸誘發(fā)的C57／BL小鼠癲癇的影響。 方法： KA腹腔注射造成小鼠癲癇模型；按照Racine's標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行癲癇行為學(xué)評分；海馬切片HE染色觀

12、察CA3區(qū)神經(jīng)元丟失情況；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察小鼠癲癇后對認(rèn)知的影響；海馬切片Timm染色觀察苔蘚纖維發(fā)芽的情況。 結(jié)果： YC-1可延長海人酸誘導(dǎo)的C57／BL小鼠癲癇發(fā)作的潛伏期；YC-1可以減輕癲癇發(fā)作造成的C57／BL小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元丟失；YC-1可以縮短癲癇的C57／BL小鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中搜索平臺的時間，并可改善癲癇發(fā)作造成的搜索策略的改變；YC-1還可以減輕癲癇發(fā)作造成的C57／BL小鼠海馬苔蘚纖維發(fā)芽。