室旁核內(nèi)Toll樣受體4對顱腦損傷后大鼠交感神經(jīng)興奮性的影響及機制研究.pdf

1、創(chuàng)傷性顱腦損傷(Traumatic Brain Injury, TBI)一直是一個困擾世界的醫(yī)療問題，TBI輕重程度往往決定患者的預(yù)后情況。重型TBI患者均可出現(xiàn)交感神經(jīng)興奮，主要表現(xiàn)為血壓、心率和血漿兒荼酚胺水平升高，并引發(fā)嚴重的顱外器官功能障礙，給患者帶來不良的臨床結(jié)局和高昂的醫(yī)療支出。目前TBI后發(fā)生交感神經(jīng)興奮的病理生理學機制尚不清楚，為臨床治療帶來極大困難。
　　既往研究表明，下丘腦室旁核(The Hypothalami

2、c Paraventricular Nucleus，PVN)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)調(diào)節(jié)交感神經(jīng)活動的關(guān)鍵部位。PVN內(nèi)的促炎細胞因子水平升高與交感神經(jīng)興奮的發(fā)生有重要關(guān)系。Toll樣受體4(Toll Like Receptor4，TLR4)是細胞表面的模式識別受體，能夠通過與環(huán)境中的配體結(jié)合啟動細胞內(nèi)信號通路激活核因子-κB(Nuclear Factor Kappa-light-chain-enhancer Of Activated B ce

3、lls,NF-κB)。激活的NF-κB復合物進入細胞核可以調(diào)控TNF-α、IL1-β等多種促炎細胞因子的基因轉(zhuǎn)錄，刺激PVN神經(jīng)元引起交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮。研究表明，TBI會導致小膠質(zhì)細胞活化，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)TLR4主要表達在小膠質(zhì)細胞上。
　　因此本研究提出以下假設(shè):(1)在顱腦損傷后，PVN內(nèi)活化的小膠質(zhì)細胞TLR4表達升高;(2) TLR4能夠激活下游的NF-κB通路，產(chǎn)生大量TNF-α和IL-1β等炎癥因子，改變了PVN內(nèi)分

4、子環(huán)境，導致交感神經(jīng)興奮的發(fā)生。
　　為驗證以上假設(shè)，本研究擬通過以下實驗，(1)利用大鼠液壓打擊模型，明確血壓、心率、心率變異性和血漿去甲腎上腺素的水平，并探索交感神經(jīng)興奮隨時間的變化規(guī)律;(2)選取最佳時間點觀察下丘腦PVN內(nèi)小膠質(zhì)細胞的活化以及TLR4在小膠質(zhì)細胞上的共表達情況;并通過PCR、Western blot和免疫組化方法檢測PVN內(nèi)TLR4、NF-κB、TNFα和IL-1β的水平;(3)分別對TLR4進行抑制和激動

5、，明確TLR4與TBI大鼠交感興奮的關(guān)系。探索TBI后TLR4對交感神經(jīng)興奮性的調(diào)控作用，為TBI后交感興奮的發(fā)病機制提供理論依據(jù)和新的治療靶點。
　　第一章 大鼠壓液打擊模型的建立與交感神經(jīng)興奮性檢測
　　目的:
　　建立大鼠顱腦損傷模型，明確TBI后發(fā)生交感神經(jīng)興奮，并探索交感神經(jīng)興奮隨時間的變化規(guī)律。
　　方法:
　　70只大鼠麻醉鉆孔固定后，經(jīng)液壓打擊儀2.1-2.3 ATM壓力打擊。存活的55只大

6、鼠中，隨機選取42只進入血漿去甲腎上腺素實驗組，進行各時間點檢測;隨機選取6只進入心率、平均動脈壓和心率變異率實驗組，進行各時間點檢測;隨機選取6只進入腦組織HE染色實驗組。隨機選取18只平均分配作為各實驗組的對照。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠液壓打擊后，死亡率達21.4％神經(jīng)反射出現(xiàn)不同程度下降或消失。平均呼吸暫停時間(18.62±2.82)s。
　　2.液壓打擊后，顱骨鉆孔處腦組織存在部分缺損。HE染色提示腦內(nèi)各部位

7、均有不同程度的神經(jīng)元變性、死亡。白質(zhì)內(nèi)可見神經(jīng)的軸突損傷，髓鞘斷裂。損傷處大量的神經(jīng)元死亡及小膠質(zhì)細胞活化，形成格子細胞。血管與腦組織間隙增加，細胞體積增大。
　　3.大鼠心率、平均動脈壓、心率變異率及血漿去甲腎上腺素水平，在TBI后24小時開始呈現(xiàn)先升高后降低的變化規(guī)律，傷后第3天達到最高值，此時各組均存在統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論:
　　1.液壓打擊后大鼠的死亡主要原因是呼吸暫停。通過制作大鼠液壓打擊模型，造成大鼠神經(jīng)

8、功能下降、神經(jīng)元變性壞死，創(chuàng)造了腦組織損傷條件。
　　2.TBI造成了大鼠交感神經(jīng)興奮。TBI后大鼠心率、平均動脈壓、心率變異率及血漿去甲腎上腺素等指標隨時間變化呈現(xiàn)相似的規(guī)律和趨勢。
　　3.TBI后24小時內(nèi)大鼠交感神經(jīng)興奮性出現(xiàn)升高，然后繼續(xù)上升至損傷后第3天附近達到最大興奮程度，隨后交感神經(jīng)興奮性呈波動下降趨勢。
　　4.TBI后第3天是交感神經(jīng)興奮性研究的最佳時間點。
　　第二章 TBI對PVN內(nèi)小膠質(zhì)

9、細胞活化及TLR4—NF-κB通路的影響
　　目的:
　　明確TBI對PVN內(nèi)小膠質(zhì)細胞、TLR4、NF-κB和促炎細胞因子的表達影響。
　　方法:
　　隨機選取經(jīng)液壓打擊后存活的大鼠24只，作為實驗組平均分配至四個亞組進行免疫熒光、免疫組化、Western blot和PCR檢測，隨機選取24只大鼠作為各亞組的對照。損傷后第72小時斷頭取腦，免疫熒光檢測小膠質(zhì)細胞Iba-1和TLR4在PVN內(nèi)及PVN旁組織的共表

10、達情況。PCR檢測TLR4在PVN內(nèi)及PVN旁組織的mRNA水平，以及PVN內(nèi)TNFα和IL-1β的mRNA水平。Western blot檢測NF-κBp65亞基、TNFα和IL-1β的蛋白水平。免疫組化方法檢測PVN內(nèi)及PVN旁組織的NF-κB水平。
　　結(jié)果:
　　1、TBI大鼠PVN內(nèi)Iba-1、TLR4和NF-κB表達量較對照組增加，差異具有統(tǒng)計學意義。實驗組和對照組大鼠的PVN旁組織內(nèi)TLR4、NF-κB和Iba-

11、1表達水平較低。
　　2、TBI大鼠PVN內(nèi)TNFα和IL-1β的mRNA和蛋白表達水平較對照組升高，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:
　　1、TBI后大鼠PVN內(nèi)小膠質(zhì)細胞活化伴隨TLR4表達上調(diào)、NF-κB、TNF-α和IL1-β含量增加。
　　2、大鼠下丘腦PVN是調(diào)控交感神經(jīng)興奮的關(guān)鍵部位，增加的炎癥因子由PVN內(nèi)產(chǎn)生。
　　3、TLR4、NF-κB、TNF-α和IL1-β水平與交感神經(jīng)興奮存在相關(guān)

12、性。
　　第三章 TLR4對TBI大鼠PVN內(nèi)NF-κB通路及交感神經(jīng)興奮性的影響
　　目的:
　　明確TLR4對PVN內(nèi)NF-κB促炎細胞因子和交感興奮的調(diào)控作用。
　　方法:
　　隨機選取經(jīng)液壓打擊后存活的大鼠60只，TBI與TBI+TAK-242組各30只，每組平均分配至五個亞組進行生命體征、血漿NE、免疫組化、ELISA和PCR檢測。隨機選取大鼠60只，Control與LPS組各30只，每組平均分配

13、至五個亞組進行生命體征、血漿NE、免疫組化、ELISA和PCR檢測。損傷后第72小時斷頭取腦，處死前24小時分別給予LPS組和TBI+TAK-242組LPS、TAK-242注射。PCR檢測TLR4在PVN內(nèi)的mRNA水平。ELISA檢測PVN內(nèi)TNFα和IL-1β的水平。免疫組化方法檢測PVN內(nèi)的NF-κB水平。
　　結(jié)果:
　　1、應(yīng)用LPS后，大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α和IL1-β水平較對照組均有明顯升高，差異

14、有統(tǒng)計學意義。TBI大鼠應(yīng)用TAK-242后TBI大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α和IL1-β水平有所下降，差異有統(tǒng)計學意義。
　　2、應(yīng)用LPS后，大鼠HR、MAP和血漿NE水平較相應(yīng)對照組均有明顯升高，而SDNN、SDNN Index則明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義。TBI大鼠應(yīng)用TAK-242后TBI大鼠HR和血漿NE水平有所下降，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:
　　1、TLR4可以通過調(diào)控NF-κB和促炎細胞因