齊墩果酸對大鼠血管平滑肌細胞中血紅素氧合酶1表達的影響及其作用機制的研究.pdf

1、研究背景：
　　 冠心病是當今全世界危害人們身體健康最常見的心臟病，位列我國心臟病住院率和死亡率之首。動脈粥樣硬化是冠心病的主要病理生理變化，動脈粥樣硬化的進展程度，特別是易損斑塊的破裂是急性冠狀動脈綜合征（ACS）、冠心病猝死等急性冠心病事件的主要“導火線”。血管平滑肌細胞（VSMCs）是構成血管壁的主要細胞，其不正常地增殖、遷移及凋亡貫穿動脈粥樣硬化的全過程。因此，如何有效地調節(jié)VSMCs的生理功能，已成為目前關心的熱點問題

2、。
　　 齊墩果酸（Oleanolic acid, OA）是從天然產(chǎn)物中提取出來的五環(huán)三萜類化合物，在我國，齊墩果酸主要用于急慢性肝炎的治療。目前，國外研究表明：OA 除對肝臟有保護作用外，在心血管系統(tǒng)也發(fā)揮著廣泛的生物學效應，如保護心肌免于缺血再灌注損傷，調節(jié)血脂，抗動脈粥樣硬化等作用。但是其作用的具體機制仍不甚清楚。血紅素氧合酶-1（Heme oxygenase-1, HO-1）是機體最重要的抗氧化酶之一，正常情況下在組織中

3、不或者低表達，當發(fā)生應激時，其表達會上調，從而發(fā)揮保護機體的作用。越來越多的實驗表明，激活HO-1能調節(jié)心血管系統(tǒng)的功能，保護其免于各種不利刺激的損傷。最近國內外研究更表明，HO-1也參與了多種治療心血管疾病藥物的作用。因此，本課題以VSMCs為研究對象，運用現(xiàn)代分子生物學技術，探討OA是否通過調節(jié)HO-1的表達來實現(xiàn)保護血管的作用，并探討其可能的機制。
　　 研究方法：
　　 第一部分齊墩果酸對血管平滑肌細胞中血紅素氧

4、合酶1表達的影響及與PI3K、MAPK通路的關系。
　　 取SD 雄性大鼠，經(jīng)手術取其胸主動脈，采用貼塊法培養(yǎng)血管平滑肌細胞，采用α-SM-actin 特異性抗體行細胞鑒定為平滑肌細胞，4-8代細胞用于實驗。將VSMCs分為：
　　 ①正常對照組，② OA （10μM）組，③ OA （25 μM）組，④ OA （50μM）組；然后放入孵箱中培養(yǎng)12小時，后取出采用RT-PCR及Western blot 檢測細胞中HO-1

5、mRNA及蛋白表達情況，分光光度法測定HO-1活性。然后取OA 最佳濃度加入VSMCs中，放入孵箱中培養(yǎng)指定時間后取出，采用Western blot 檢測細胞中HO-1的表達。
　　 將VSMCs分為：正常對照組和OA不同時間作用組，提取細胞蛋白，采用Wes t er nblot 法檢測細胞中磷酸化Akt及磷酸化MAPKs的表達情況。通過上一步實驗確定能被OA 激活的激酶，在下一步實驗中采用相應的阻斷劑與OA作用于細胞，分為：①

6、正常對照組，② OA組，③ OA+相應阻斷劑組。干預后放入孵箱中培養(yǎng)指定時間后，取出提取蛋白，行Western blot 法檢測HO-1的表達。
　　 第二部分轉錄因子Nrf2在齊墩果酸調控血管平滑肌細胞血紅素氧合酶1表達中的作用。
　　 將VSMCs分為：①正常對照組，② OA （10μM）組，③ OA （25 μM）組，④ OA（50μM）組；在孵箱中培養(yǎng)4小時候后取出，提取細胞核蛋白，Western blot 檢測

7、細胞核中Nf2的表達變化。確定OA能激活Nrf2后，加入相應阻斷劑，實驗分為：①正常對照組，② OA組，③ OA+相應阻斷劑組。在孵箱中培養(yǎng)指定時間后，取出提取細胞核蛋白，行EMSA 檢測Nrf2 結合活性。
　　 將構建好的Nrf2 干擾慢病毒載體轉染細胞，Western blot 測定Nrf2的表達，確定是否干擾成功。將VSMCs分為：①對照載體轉染組，② OA+對照載體轉染組，③ Nrf2干擾慢病毒載體轉染組，④ OA+N

8、rf2 干擾慢病毒載體轉染組。采用Western blot 法檢測細胞中HO-1的表達變化。
　　 第三部分齊墩果酸對血管平滑肌細胞氧化應激損傷的保護作用及其機制實驗先采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT）確定過氧化氫（H2O2）誘導血管平滑肌細胞損傷的最佳濃度，然后實驗分為：①正常對照組，②H2O2組，③ OA+H2O2組，④ OA+H2O2+ZnPP組，⑤ OA+H2O2+相應阻斷劑組。采用MTT、Hoechst333

9、42 法或流式細胞儀檢測細胞凋亡及壞死情況。
　　 然后將實驗分為：①正常對照組，②過氧化氫（H2O2）組，③ OA （10μM）+H2O2組，④ OA （25 μM）+H2O2組，⑤ OA （50μM）+H2O2組。采用相應試劑盒測定細胞中谷胱甘肽（GSH）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）及超氧化物歧化酶（SOD）的變化。
　　 研究結果：
　　 （1）OA在10、25、50μM濃度范圍內都能上調

10、VSMCs中HO-1的活性、mRNA及蛋白水平，呈現(xiàn)濃度依賴性，并且在50μM濃度時，OA 誘導VSMCs中HO-1表達的作用最強，故此以后實驗均采用50μM濃度進行細胞干預。
　　 （2）OA作用于VSMCs不同時間后，HO-1蛋白表達呈現(xiàn)不同程度地上調，6小時時HO-1表達最強，隨后，HO-1蛋白表達逐漸減弱。
　　 （3）OA作用于VSMCs后，能使細胞中磷酸化的Akt、ERK及p38 激酶表達增強。
　　

11、 細胞分別經(jīng)PI3K 抑制劑wortmannin，ERK 抑制劑PD98059及p38 抑制劑SB203850預處理后，Western blot 顯示wortmannin及PD98059 預處理組較單純OA組的HO-1表達顯著下調；SB203850預處理組的HO-1表達與單純OA組比無顯著變化。
　　 （4）不同濃度的OA作用于VSMCs 4小時，能激活細胞中Nrf2的核轉錄，且呈現(xiàn)濃度依賴性。細胞分別經(jīng)wortmannin及P

12、D98059 預處理后，與單純OA組比較，細胞中Nrf2 結合活性顯著減弱。
　　 （5）Nrf2 干擾慢病毒成功瞬時轉染VSMCs，Nrf2 siRNA 轉染組與control siRNA組比較，細胞核Nrf2表達顯著減弱；OA+Nrf2 siRNA組與OA+control siRNA組比較，HO-1蛋白表達顯著下調。
　　 （6）不同濃度的H2O2作用于VSMCs 24小時，能導致細胞不同程度的死亡，并呈現(xiàn)濃度依賴性

13、，當濃度達到400μM時開始出現(xiàn)顯著的細胞毒性作用，故此以后實驗采用400μM H2O2作用于細胞。與H2O2組比較，OA 各劑量組細胞GSH、NADPH及SOD含量均有不同程度的上升，其中25、50μM組具有統(tǒng)計學意義。與OA+H2O2組相比，經(jīng)ZnPP （HO-1活性抑制劑）、wortmannin及PD98059 預處理組，細胞活性顯著降低。
　　 結論：
　　 （1）OA能上調大鼠血管平滑肌細胞中HO-1的mRNA

14、及蛋白表達，伴有HO-1活性的增強。
　　 （2）OA通過激活大鼠血管平滑肌細胞Akt、ERK通路誘導HO-1的表達。
　　 （3）OA能激活大鼠血管平滑肌細胞中Nrf2 轉錄因子，Akt及ERK通路參與其中。
　　 （4）Nrf2 轉錄因子參與了OA 誘導的HO-1表達。
　　 （5）OA能減輕H2O2導致的大鼠血管平滑肌細胞氧化損傷，可能是通過增加HO-1等抗氧化酶的活性來實現(xiàn)的。
　　 由此